加味濟生腎氣湯對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用

江波， 孫勤國， 謝萍， 施燕， 黃天慧

（1.武漢大學同仁醫院/武漢市第三醫院中醫科，湖北武漢430060；2.湖北中醫藥大學，湖北武漢430065）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）的慢性微血管并發癥，也是最終導致糖尿病患者死亡的重要原因[1]。其在糖尿病并發癥中占30%～40%[2]。因此，加強糖尿病及其并發癥糖尿病腎病的治療研究具有重要意義。中醫藥治療糖尿病腎病具有療效溫和、持久、不良反應少的優點。濟生腎氣丸出自宋代嚴用和《濟生方》，有溫腎陽、散瘀結、行氣利水的作用[3]。本課題組以此方為基礎加減變化，臨床應用加味濟生腎氣湯治療糖尿病腎病有明顯療效，但其作用機制尚不清楚。故本研究觀察不同劑量的加味濟生腎氣湯對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病腎病大鼠腎臟功能的保護作用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物66只SPF級日齡90 d雌性SD大鼠，體質量為（232.5±14.3）g，購于湖北省疾病預防控制中心，動物質量合格證號：42000600026493。飼養于華中農業大學實驗動物中心，室溫23℃左右，自然光源，自由飲水。

1.2 藥物 加味濟生腎氣湯方藥組成：肉桂6 g，制附片8 g，熟地15 g，山藥25 g，山茱萸15 g，茯苓20 g，澤瀉8 g，丹皮8 g，懷牛膝15 g，車前子10 g，黃芪25 g，熟大黃8 g，桃仁10 g，穿山甲25 g。方中中藥材均采購于武漢市第三醫院藥學部。加水1 000mL，水煎2遍，煎煮至200mL備用。

1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素（STZ）（購于北京索萊寶科技有限公司）；血糖酶聯免疫吸附分析（ELISA）測試盒、胰島素（INS）ELISA測試盒、糖化血紅蛋白（HbA1c）ELISA測試盒、尿素氮（BUN）ELISA測試盒、內皮素（ET-1）ELISA測試盒、微量白蛋白尿（UmAlb）ELISA測試盒、ELISA測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；血清胱抑素C（Cys-C）ELISA測試盒（上海撫生實業有限公司）；血肌酐（SCr）ELISA測試盒（上海紀寧實業有限公司）。ELx800TM酶標儀（美國Bio-Tek公司）；Leica RM2235石蠟切片機（中國上海徠卡公司）。

1.4 分組、造模與給藥 將大鼠隨機分成正常組（N=11），造模組（N=55）。2組適應性喂養7 d后，進行模型的構建和相應處理。造模方法：給予大鼠喂養高糖高脂飼料（含豬油20%、白糖20%、蛋黃粉6%、基礎飼料54%）5周后，禁食12 h，腹腔注射劑量為25 mg/kg的鏈脲佐菌素（STZ），每天1次，注射3 d。檢測空腹血糖（FBG），FBG含量＞11mmol/L，即表明糖尿病腎病模型復制成功[4]。統計成模率，未成模者予剔除實驗。再將造模成功的大鼠隨機分為模型組、羥苯磺酸鈣組，中藥低、中、高劑量組。將備用的加味濟生腎氣湯按照灌胃劑量稀釋到10mL，中藥低、中、高劑量組給予加味濟生腎氣湯（劑量分別為0.94、3.76、9.40 g·kg-1·d-1）灌胃。羥苯磺酸鈣組灌胃羥苯磺酸鈣100mg·kg-1·d-1。正常組、模型組等體積生理鹽水灌胃。每天1次，連續6周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 觀察大鼠一般情況 觀察大鼠精神狀態、毛色、飲水量、攝食量、尿量，統計并記錄各組大鼠體質量，對外界刺激的反應、死亡情況等。

1.5.2 免疫比濁法檢測24 h尿微量白蛋白（24hUmAlb）含量 采用代謝籠收集動物24 h尿液（每籠動物3～5只），計量尿量。按尿總蛋白測定試劑盒說明書操作，簡要步驟如下：使用8孔板，每孔加入200μL試劑R1，之后每孔加入10μL樣品或者標準品，37℃下孵育10min，于600 nm處讀取吸光度（D）。按標準品繪制出的標準曲線計算樣品尿蛋白濃度。平均每只動物的24 h尿蛋白總量=樣品尿蛋白濃度×尿量/動物只數。

1.5.3 ELISA法檢測FBG、INS、BUN、SCr、Cys-C、ET-1、HbA1c水平 藥物干預結束、空腹12 h后，給予大鼠100 g/mL水合氯醛腹腔注射麻醉（劑量為0.3mL/100 g）。用組織剪沿腹中線剪開皮膚、肌肉，充分暴露腹腔，進行腹主動脈采血。以3 000 r/min離心10min，分離血漿和血清，抗凝標本。血漿用于HbA1c檢測，血清用于BUN、SCr、Cys-C、ET-1的檢測，所有檢測均在室溫下2 h內檢測完畢。ELISA法操作步驟：根據試劑盒說明書稀釋標準品。繪制標準曲線。在酶標包被板上設標準品孔，依次加入不同濃度的標準品50μL。分別設空白孔（空白對照孔不加樣品、酶標試劑及生物素標記的抗體，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40μL，然后再加生物素標記的抗體10μL。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃溫育30min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min。每孔加終止液50μL，終止反應。

1.5.4 蘇木素—伊紅（HE）染色觀察腎組織病理變化 將大鼠腎臟組織經過脫水，包埋，以6μm的厚度均勻切片。將蘇木精加入蒸餾水內加溫溶解，冷卻后加入酒精和甘油，備用。石蠟切片脫蠟至水。用蘇木精液染核7min。置于容器中，流水沖洗2 h。以1%的鹽酸酒精溶液分化3 s，用伊紅染液染色5～10min。用體積分數95%酒精、無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.6 統計方法 采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析。計量數據以均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病腎病大鼠成模率55只大鼠，共有47只大鼠造模成功，其中8只大鼠注射STZ后血糖仍未達到16.7mmol/L，予以剔除，成模率為85.5%。0只大鼠在高糖高脂飼料喂養期間死亡。中藥中劑量組1只在STZ注射后，藥物治療第5周死亡，死亡率為2%。最終共46只大鼠參與造模后的實驗，其中：模型組，10只；羥苯磺酸鈣組，9只；中藥低劑量組，10只；中藥中劑量組，9只；中藥高劑量組，9只。

2.2 各組大鼠一般情況比較 正常組大鼠精神狀態良好，毛發濃密均勻有光澤，反應靈敏，體質量顯著增加。模型組大鼠精神狀態較差，反應緩慢，毛發粗糙而凌亂無光澤，多飲、多食、多尿癥狀比較明顯，形體消瘦。中藥高、中、低劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠精神狀態、活動以及反應情況略差于正常組大鼠，體質量增長速度較慢，后期上述癥狀有所緩解。

2.3 治療結束后各組大鼠體質量值比較 在治療第5周結束時，檢測各組大鼠的體質量值，結果見圖1。與正常組比較，模型組大鼠體質量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，羥苯磺酸鈣組，中藥中、高劑量組大鼠體質量顯著升高（P＜0.05）；中藥低劑量組大鼠體質量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。提示加味濟生腎氣湯可提高糖尿病腎病大鼠體質量，且呈劑量依賴性。

圖1 治療結束后各組大鼠體質量值比較Figure 1 Com parison of the ratbodymass values in various groups after treatmentending（）

2.4 各組大鼠FBG、INS水平比較 圖2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠FBG、INS水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠FBG、INS水平均顯著降低（P＜0.05）。提示加味濟生腎氣湯可改善糖尿病腎病大鼠FBG、INS水平，且呈劑量依賴性。

2.5 各組大鼠腎功能比較 圖3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠BUN、SCr、Cys-C、ET-1、HbA1c及24hUmAlb水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和羥苯磺酸鈣組的BUN、SCr、Cys-C、ET-1、HbA1c及24hUmAlb水平均顯著降低（P＜0.05）。提示加味濟生腎氣湯可改善糖尿病腎病大鼠腎功能，且呈劑量依賴性。

圖2 各組大鼠FBG、INS水平比較Figure 2 Com parison of the levels of FBG and INS in various groups（）

2.6 各組大鼠腎組織病理變化比較 圖4結果顯示：模型組腎小球體積增加，系膜細胞和系膜基質增生，系膜區變寬，基底膜增厚，毛細血管環增多，腎小管上皮細胞腫脹，融合，壞死，腎小球系膜區大量炎性細胞浸潤。中藥中、高劑量組以上癥狀均得到明顯改善，中藥低劑量組改善不明顯。

3 討論

圖3 各組大鼠腎功能比較Figure 3 Com parison of the renal function in various groups（）

圖4 各組大鼠腎組織病理變化比較（HE染色，×200）Figure 4 Com parison of the pathologicalchanges of kidney tissues in various groups（by HE staining，×200）

糖尿病腎病是糖尿病的嚴重并發癥之一，缺乏有效治療和控制會導致終末期腎病（ESRD）的發生[5，6]。早期糖尿病腎病最常見的臨床表現之一是尿白蛋白排出量的增加[7]，一旦出現臨床蛋白尿[尿微量白蛋白（UmAlb）＞0.5 g/24 h]，腎小球功能則呈進行性下降，若出現大量蛋白尿，則逐漸出現腎功能損害。24 hUmAlb為糖尿病腎病嚴重程度的衡量標志之一，加速腎臟病變的進展，因此降低蛋白尿可以減少腎臟的持續損傷[8-10]。血液生化指標BUN、SCr常用于指示糖尿病腎病炎性和腎臟功能狀態。SCr水平的升高、體質量的增加、血糖的升高等都是蛋白尿發生的重要危險因素。本研究結果顯示，加味濟生腎氣湯可顯著降低糖尿病腎病大鼠BUN、SCr、24 hUmAlb水平，提示加味濟生腎氣湯可有效改善糖尿病腎病大鼠腎功能。

Cys-C是由122個氨基酸組成的相對分子質量約為13 kDa的低分子蛋白質，廣泛存在于體液和有核細胞內[11]。亦是一種不受血脂、年齡等干擾的半胱氨酸蛋白酶抑制物，能自由地通過腎小球，在近曲小管處被降解，不再回到血液中。腎小管不能分泌Cys-C，腎臟是清除Cys-C在體內循環的唯一器官，故Cys-C可作為評價腎功能的指標[12，13]，能夠很好地反映腎臟的濾過功能。本研究結果顯示，加味濟生腎氣湯可顯著降低Cys-C的含量，提示加味濟生腎氣湯能提高STZ誘導糖尿病腎病大鼠腎臟的濾過功能。

內皮素（ET-1）是作用最強的血管舒縮因子之一，與糖尿病早期腎小管間質損傷密切相關[14，15]，正常生理情況下，ET-1水平很低，但在病理狀態下，高血糖、高脂血癥或受刺激后ET-1局部合成增多[16]。HbA1c和腎小球濾過率的縱向變化可精確地預測早期糖尿病腎病的發生，HbA1c能反映1～2個月前的平均血糖水平，是反映糖尿病較長時間血糖控制水平的良好指標[17-19]。本研究發現，ET-1和HbA1c水平在正常組、中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組和模型組間呈現依次升高的變化趨勢。說明加味濟生腎氣湯對STZ誘導糖尿病腎病大鼠腎臟具有保護作用。在病理組織學方面，加味濟生腎氣湯可明顯改善糖尿病腎病大鼠腎組織病理損傷。