三黃清胃丸治療幽門螺旋桿菌相關性胃炎主要活性成分及潛在靶點的網絡藥理學分析

林道斌， 楊華， 程亞偉， 張達坤， 楊永和， 蔡媛媛， 舒盼， 謝紅丹

（廣州中醫藥大學附屬海南省中醫院脾胃肝病科，海南海口570000）

自20世紀80年代Marshall和Warren成功從胃黏膜中分離出幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，HP）以來，因HP引起的慢性胃炎受到了越來越多學者們的關注，針對HP的抗菌方案也不斷發生變化。目前，根據美國胃腸病學院（American College of Gastroenterology，ACG）發布的最新臨床指南[1]，西藥抗菌的一線方案電抗生素及質子泵抑制劑（PPI）組成。但藥物的副作用和細菌耐藥性日益凸顯，因此，尋找安全、副作用少的新的治療方法十分必要。

海南省中醫院脾胃肝病科楊永和主任醫師根據自身數十年臨床經驗，并結合全國名老中醫羅凌介的學術思想研制的三黃清胃丸[2]對幽門螺旋桿菌相關性胃炎（helicobacter pylori-associated gastritis，HAG）的治療表現了良好的效果，其治療后復發率和副作用遠遠低于西藥治療方案。雖然通過臨床觀察試驗已經明確了三黃清胃丸的臨床療效，但關于其藥物的主要成分及作用機制仍不明確，而通過網絡藥理學[3]方法對三黃清胃丸進行整體研究，不但有利于下一步深入進行實驗研究，也有利于該藥的推廣和應用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 三黃清胃丸有效成分的篩選 本研究通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索三黃清胃丸組成藥物半夏、黃連、黃芩、干姜、甘草、人參、大黃的所有活性成分。再根據口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18進一步篩選藥物的主要活性成分。OB和DL是評判藥物有效利用度的關鍵指標，一般而言OB≥30%、DL≥0.18的活性成分可視為藥物的主要活性成分[4]。

1.2 藥物作用靶點的篩選 將“1.1”項獲得的藥物成分化學結構的mol2格式文件反向分子對接服務器（DRAR-CPI）（http：//cpi.bio-x.cn/drar/）數據庫[5]，根據對接分數（Z-score）＜-1篩選靶點蛋白PDB ID，并導入Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數據庫[6]獲取靶點基因。

1.3 疾病相關靶點的獲取和三黃清胃丸治療HAG潛在靶點篩選 在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）[7]中以幽門螺旋桿菌相關性胃炎的英文關鍵詞“helicobacterpylori associated gastritis”或“helicobacterpylori related gastritis”作為關鍵詞，搜索HAG的疾病相關靶點并建立數據集，再與“1.2”項所得的藥物作用靶點進行Venn分析，將兩者交集靶點作為三黃清胃丸治療HAG的直接作用靶點。為了更加直觀地分析藥物的作用機制，將藥物活性成分與核心靶點輸入Cytoscape 3.6.1軟件構建活性成分—潛在靶點網絡關系圖，并根據網絡節點的相關拓撲參數作進一步分析。

1.4 基因本體論（GO）功能注釋及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 最后再將篩選出的三黃清胃丸治療HAG的潛在靶點導入DAVID在線工具（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO、KEGG功能注釋和富集分析。

2 結果

2.1 三黃清胃丸有效成分及藥物靶點的篩選結果 通過TCMSP數據庫分別檢索相關藥物，并按OB≥30%和DL≥0.18作為條件共獲得174種活性成分，研究過程中我們發現有9種活性成分為多個藥物共有成分，為使統計結果準確，我們將其單獨歸為一類，分別是黃芩、半夏共有的黃芩素（baicalein），半夏、人參、黃芩、干姜、大黃共有的β-谷甾醇（beta-sitosterol），黃芩、黃連共有的黃連堿（coptisine），人參、黃芩共有的Diop，黃連、黃芩共有的表小檗堿（epiberberine），人參、甘草共有的山柰酚（kaempferol），黃連、甘草共有的槲皮素（quercetin），黃芩、干姜、甘草共有的谷甾醇（sitosterol），半夏、人參、黃芩共有的豆甾醇（stigmasterol）。其余藥物活性成分篩選結果為甘草85種、黃芩24種、人參13種、半夏9種、大黃9種、黃連8種、干姜3種。藥物靶點通過DRARCPI平臺共檢索到2 499個，去重保留唯一值后有341個。

2.2 疾病相關靶點及三黃清胃丸治療HAG潛在靶點篩選結果 通過GeneCards數據庫檢索到707個HAG疾病相關靶點，與“1.2”項獲取的藥物作用靶點進行Venn分析后，得到交集靶點94個，這94個靶點可視為三黃清胃丸治療HAG潛在靶點。見圖1。

圖1 藥物靶點與HAG疾病靶點韋恩分析圖Figure 1 The Venn diagram ofdrug targets and HAG disease-related targets

2.3 活性成分—潛在靶點網絡關系圖 將藥物活性成分與潛在靶點輸入Cytoscape 3.6.1軟件后，建立了一個各個節點聯系密切的網絡關系圖，見圖2。在該圖中活性成分節點有140個，靶點節點94個。圖中，紅色節點代表靶點，紫色節點代表甘草活性成分，淡藍色節點代表黃芩活性成分，淺綠色代表共有活性成分，深綠色代表人參活性成分，紫紅色代表半夏活性成分，淡紅色代表黃連活性成分，黃色代表大黃活性成分，深藍色節點代表干姜活性成分。本研究還運用Cytoscape 3.6.1軟件中的Network Analysis-Analyze Network插件對該網絡圖中的每個節點進行分析，得到網絡中各個節點的度值（Degree）。Degree在活性成分節點表示該活性成分所對應的靶點個數，在靶點節點表示能與該靶點發生作用的活性成分個數，這意味著Degree值越大，在三黃清胃丸治療HAG的過程中所發揮的作用也越大。

圖2 活性成分—靶點相互作用網絡關系圖（節點大小與Degree成正比）Figure 2 Active component-target interaction networks（Node size is in directproportion to Degree）

通過分析結果我們得出，平均每個活性成分能作用于5個靶點，有30%的活性成分作用靶點高于均值，可視為三黃清胃丸治療HAG的關鍵活性成分，而Degree最高的前5種活性成分分別為槲皮素68個、山柰酚22個、漢黃芩素（wogonin）20個、黃芩素14個、蘆薈瀉素（aloe-emodin）12個。在靶點方面，平均每個靶點能與8種活性成分聯系，有12%的靶點高于均值，這也意味者這些靶點可能是三黃清胃丸治療HAG的關鍵靶點，其中前5個靶點前列腺素G/H合酶2（PTGS2）對應了133種活性成分，前列腺素G/H合酶1（PTGS1）和一氧化氮合酶2（NOS2）都對應了87種，過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（PPARG）對應了70種，糖原合成酶激酶3β（GSK3B）對應了59種。表1、2分別列舉了高于Degree均值的靶點、活性成分。

表1 在活性成分—靶點網絡中高于靶點均值的基因Table 1 Genes above the targetmean value in active com ponent-targetnetworks

表2 活性成分—靶點網絡中的活性成分關鍵節點拓撲學性質及其來源Table 2 Topologicalproperties and origin of key nodes ofactive com ponents in com ponent-targetnetworks

2.4 GO功能注釋及KEGG通路富集分析結果 利用DAVID平臺的GO和KEGG通路富集分析功能對94個靶點進行研究，GO富集分析中根據錯誤發現率（FDR）＜0.01確定了350個條目，其中涉及生物過程的有288條，如凋亡過程的負調控、對藥物反應、對乙醇反應等。涉及細胞組成的有26條，如細胞外間隙、細胞質基質、線粒體。涉及分子功能的有36條，如酶結合、蛋白結合、蛋白激酶結合等。同時根據FDR＜0.01還找到了89條信號通路，根據FDR由小到大排名前10的有癌癥通路、乙型肝炎通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、膀胱癌通路、弓形體病通路、南美錐蟲病通路、直腸癌通路、胰腺癌通路、前列腺癌通路、Nod樣受體（NOD）受體信號通路。表3、4，圖3、4根據FDR＜0.01分別列出了前20條GO條目、KEGG通路。

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法對海南省中醫院院內制劑三黃清胃丸治療HAG的主要活性成分及潛在靶點進行了研究。研究發現，前5種作用靶點最多的活性成分中，共有化合物槲皮素的作用靶點最多，能通過抗炎[8]、抑制HP[8]、抗細胞氧化[9]等途徑發揮治療作用。另一共有成分山柰酚，也具有類似的抗炎[10]及抑制HP[11]作用。漢黃芩素能通過調節花生四烯酸的代謝，減少細胞凋亡，減輕胃黏膜炎癥反應[12]。黃芩素是黃芩的主要活性成分之一，不但具有較強的清除氧自由基，抗氧化、減少促炎因子釋放，降低炎癥反應的作用[13]，而且是目前最為人所熟知的抗HP的中藥活性成分之一，其抗HP的機理可能與減輕細菌毒力和抑制細菌繁殖有關[14]。有研究[15]表明蘆薈瀉素可以通過抑制HP中的乙酰轉移酶的活性，進而抑制HP的生長。

除此之外，我們通過三黃清胃丸的活性成分—靶點網絡中還發現了94個三黃清胃丸治療HAG的直接作用靶點，其中有12個靶點的Degree高于均值，包括PTGS2、PTGS1和NOS2等。前列腺素G/H合酶又稱環氧化酶（COX），PTGS2和PTGS1屬于環氧化酶的2種同工酶，兩者在功能上既有差別又有聯系，共同參與機體穩態和炎癥的前列腺素合成[16]。其中COX1是固有型酶，廣泛存在于胃腸道和腎臟，促進生理性前列腺素（PG）的生成[17]，對消化道黏膜起著保護作用。COX2是誘導型酶，在正常組織中活性極低，但在炎癥的刺激下其表達水平可上調，并依賴其環氧化活性和過氧化活性，將花生四烯酸在各種刺激因子的作用下釋放的磷脂酶A2轉化為前列腺素的中間代謝產物前列腺素G2（PGG2）和前列腺素H2（PGH2），再在其他前列腺素合成酶的作用下產生具有生物活性的前列腺素[18]，導致疼痛和炎癥反應。因此，多種成分對環氧化酶的共同調控對整個HAG治療過程有著重要意義。

表3 94個潛在靶點的GO分析結果（FDR＜0.01）Table 3 GO enrichment results for 94 Drug targets（FDR＜0.01）

表4 94個潛在靶點的KEGG分析結果（FDR＜0.01）Table 4 KEGG pathways enrichment results for 94 potentialDrug targets（FDR＜0.01）

圖3 94個潛在靶點的GO分析結果條形圖（FDR＜0.01）Figure 3 Bar chartofGO enrichment results for 94 potentialDrug targets（FDR＜0.01）

圖4 94個潛在靶點的KEGG分析結果氣泡圖（FDR＜0.01）Figure 4 Bubble chartofpathways enrichment results for 94 potentialdrug targetgenes（FDR＜0.01）

NOS2和一氧化氮合酶3（NOS3）分別是一氧化氮合酶（NOS）的誘導型和內皮型酶。正常生理情況下，低濃度的NOS對胃黏膜的黏液分泌和血液循環有著積極作用[19]，但在病理狀況下如HP的刺激會使NOS的表達水平升高[20]，使一氧化氮（NO）與氧產生大量氧代謝產物，這些產物與蛋白質、核酸等結合后會對機體的組織細胞產生毒性，降低胃黏膜屏障功能[21]。特別是在HP感染的條件下，胃黏膜中的氧化和硝酸基程度較高，與過量NO結合后會產生強致癌物質亞硝胺，對HAG的演變造成不良影響[22]。因此，對NOS3和NOS2的調控可能是三黃清胃丸治療HAG的一個重要途徑。

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）是一類由配體激活的轉錄因子，目前已發現有3種亞型PPARα、PPARβ、PPARγ等[23]。其中由PPARG編碼的PPARγ不但對HP感染的胃黏膜表現出抗炎和細胞保護作用[24]，而且因為能夠抑制細胞異常增殖和促進癌細胞凋亡的作用成為了目前腫瘤研究的熱點[25]。而其抗腫瘤的一項重要機制與B淋巴細胞瘤2（BDL2）密切相關，有報道[26]稱，PPARγ能抑制BCL2的過度表達誘導胃癌MGC803細胞凋亡。另一靶點GSK3B在HP感染時，HP的主要毒性因子CagA與GSK3B基因結合使不可溶部分增加，降低其活性，并且可通過消耗GSK3B誘導上皮細胞—間充質轉化（EMT），整個過程不僅會產生急慢性炎癥，還會導致癌癥的發生[27]。而根據KEGG富集分析結果，癌癥通路富集基因最多，據此可以推測三黃清胃丸可在一定程度上對HAG的癌變有干預作用。

MAPK14是絲裂原蛋白激酶14，又稱為P38α。HP的類脂多糖可誘導P38α的活化[28]，從而介導炎癥因子的釋放產生炎癥反應。所以抑制P38α的活化可能是三黃清胃丸對HAG治療的一個重要方面，而且已有研究[29]表明，P38是人參皂苷降低炎癥反應的一個重要靶點，通過抑制P38α及其他炎癥因子的活性發揮作用。

毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3（CHRM3）廣泛分布于中樞和外周神經系統，控制著平滑肌收縮及腺體組織的分泌功能[30]，在刺激狀態下特別是膽汁酸等因素的作用下，會促進胃蛋白酶原和胃酸的分泌，進一步加劇胃黏膜的損害[31，32]。5-羥色胺（5-HT）轉移蛋白基因（SLC6A4）蛋白是一種膜傳遞蛋白，其對胃腸道的作用主要通過該基因編碼的5-HT轉運體（SERT）實現，SERT的生理作用是將發揮功效后的5-HT再攝取進行滅活[33]，若SERT的表達量及活性降低，則會引起胃腸道內游離5-HT增多，5-HT及其亞型可增強胃腸道的功能運動[34]。而胃腸活動對消化道慢性炎癥有一定的改善。所以可以推測三黃清胃丸主要成分對于SLC6A4的調節作用可能類似于5-HT再攝取抑制劑的作用。半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的一種亞族，起著細胞凋亡執行者的作用[35]。在HAG疾病過程中胃上皮細胞凋亡是胃黏膜損傷的一個重要標志[36，37]，其方式之一便是HP上調CASP3的表達，下調粘鈣蛋白E的表達通過線粒體途徑誘導凋亡[38]。所以作用于CASP3靶點暗示著抗細胞凋亡也是三黃清胃丸療效的一個重要方面。CA2是碳酸酐酶（CA）的14種形式之一，CA是一種含鋅金屬酶，在機體內對二氧化碳和水轉化為碳酸氫鹽起著催化作用，并對胃中鹽酸的分泌起作用[39]。而提高胃內pH值可提高根除HP的效果[40]，所以相關成分作用于CA2靶點可能是通過調節胃內酸堿環境配合其他成分對HP的滅活。

另外，本研究還對94個治療靶點做了KEGG通路富集分析。根據FDR＜0.01確定了89條作用通路，FDR最小的前10條通路中有3條與HAG相關，除了文中的癌癥通路，還有TNF信號通路以及NOD樣受體信號通路。TNF是一種細胞信號因子，介導著多個系統的炎癥反應，是炎癥急性期的主要細胞因子[41]，可在HP脂多糖的刺激下[42]觸發多項級聯反應，誘導細胞凋亡[43]。而NOD屬于胞內識別受體，可在危險相關分子模式和病原相關分子模式的激活下[44]，與其適配器蛋白凋亡相關斑點樣蛋白和半胱天冬氨酸蛋白酶原結合形成炎癥小體，誘導炎癥反應[45]。所以，三黃清胃丸可能通過作用于上述信號通路及其他通路對HP誘發的慢性胃炎進行調控。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法對三黃清胃丸治療HAG的作用機制進行了分析，發現了140種可直接作用于HAG靶點的活性成分以及94個潛在靶點，并通過KEGG通路富集分析確定了89條作用通路，結果與目前文獻報道基本吻合，證明了其科學性。同時上述研究成果也給我們下一步研究指明了方向，為在動物實驗中深入探討三黃清胃丸治療HAG的作用機制奠定了基礎。