酸棗仁藥材UPLC指紋圖譜研究

雷橋仕， 魏梅， 孫冬梅， 梁慧， 童培珍， 王燕雄， 官永河

（廣東一方制藥有限公司，廣東佛山528244）

酸棗仁是鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子[1]，主要分布在我國遼寧、河北、河南、山東、山西等地區。中醫臨床常以酸棗仁為君藥組方治療虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴等癥。研究表明，酸棗仁含有皂苷類、黃酮類、生物堿、脂肪酸、氨基酸、酸棗多糖及微量元素[2，3]，具有鎮靜、催眠、降壓、降血脂等多種藥理作用[4-6]。由于其良好的療效及廣泛的臨床應用，市場需求量增大、價格上漲，導致出現偽品及摻偽品。目前，酸棗仁藥材甄偽鑒別主要依賴于性狀、顯微及薄層色譜鑒別，而理棗仁色澤質地與酸棗仁極為相似，且有學者認為理棗仁亦含有酸棗仁的主要有效成分[7，8]，帶來了甄別上的困難，故急需在指紋圖譜技術指導下開展全成分質量控制研究。文獻報道酸棗仁指紋圖譜研究主要為高效液相色譜—蒸發光散射檢測器（HPLCELSD）指紋圖譜以及部分低波長高效液相色譜—紫外分光光度（HPLC-UV）指紋圖譜[9，10]，其雖然分析信息全面，但是檢測信號基線漂移嚴重，容易丟失峰信息且精密度較差。因此，本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法進行酸棗仁指紋圖譜研究，建立更快速、穩定且重現性好的方法，以期為酸棗仁藥材質量控制提供科學的新方法，現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器Waters高效液相色譜儀（美國Waters公司，PDA檢測器），Empower 3.0色譜工作站。Waters ACQUITYUPLCTMI-Class型超高效液相色譜儀；沃特世超高效液相飛行時間高分辨質譜聯用系統（Xevo G2-XSQ-TOFMS），UNIFI 1.8工作站（英國曼徹斯特Waters公司）；ME204E萬分之一分析天平、XP26百萬分之一分析天平（瑞士梅特勒—托利多公司）；KQ-500DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；Milli-QDirect超純水系統（美國默克股份有限公司）。

1.2 試劑 乙腈（默克股份有限公司，色譜純）；甲酸（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純）；甲醇（天津市富宇精細化工有限公司，分析純）；水為超純水；斯皮諾素（批號：B221711108，含量：98%，中國食品藥品檢定研究院）；木蘭花堿（批號：150813，含量：≥98%，成都普菲德生物科技有限公司）。

1.3 試藥 酸棗仁藥材S1～S18為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，理棗仁藥材L19～L23為鼠李科植物滇刺棗zizyphuomauritsana Lam.的干燥成熟種子，見表1。酸棗仁對照藥材（批號：121517～201604，中國食品藥品檢定研究院），經廣東一方制藥有限公司質量中心鑒定。

表1 酸棗仁及理棗仁藥材產地信息Table 1 Information of habitats of Semen Ziziphi Spinosae and Semen ZiziphiMauritianae sam p les

2 方法與結果

2.1 液相色譜及質譜參數

2.1.1 UPLC條件 色譜柱為Waters Cortecs T3（100mm×2.1mm，1.6μm）。以乙腈（A）—0.05%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫：0～7min，3%～15%A；7～10min，15%～17%A；10～15min，17%～17%A；15～20 min，17%～25%A；20～25 min，25%～90%A。柱溫：35℃；檢測器：PDA；檢測波長：254 nm；流速：0.4mL/min；進樣體積：1μL。

2.1.2 質譜參數 氮氣作為質譜離子源的霧化、錐孔氣；電噴霧電離正離子模式；毛細管電壓：2.0 kV；錐孔電壓：40 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：450℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；掃描時間：0.5 s；掃描時間間隔：0.02 s；質荷比范圍：50∶1 200；數據采集模式：ESI（+/-）下采集MSE；以甲酸鈉溶液校正質量軸，以亮氨酸腦啡肽（leucine-enkephalin）為內標校正質量精度，錐孔氣體流量：50 L/h。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取斯皮諾素、木蘭花堿對照品適量，用甲醇配制成每1mL含斯皮諾素20μg、木蘭花堿15μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取酸棗仁藥材粉末（過65目篩）1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加體積分數70%甲醇20mL，稱定質量，加熱回流提取60min，放冷。再稱定質量，用體積分數70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取“2.3”項下的供試品溶液，按“2.1”項下的液相色譜條件連續進樣測定，記錄指紋圖譜。結果顯示，各色譜峰的相對保留時間相對標準偏差（RSD，sR）均＜3%，相對峰面積sR均＜5%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 按“2.3”項下的方法制備供試品溶液6份，“2.1”項下的液相色譜條件進樣測定，記錄指紋圖譜。結果顯示，各色譜峰的相對保留時間sR均＜3%，相對峰面積sR均＜5%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取“2.3”項下的供試品溶液，按“2.1”項下的液相色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h進樣測定，記錄指紋圖譜。結果顯示，各色譜峰的相對保留時間sR均＜3%，相對峰面積sR均＜4%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.5 結果與分析

2.5.1 酸棗仁色譜峰的液相色譜—質譜（LC-MS）鑒定 酸棗仁及理棗仁藥材的指紋圖譜比較見圖1。本研究按擬定的液相色譜及質譜條件，通過對照品比較和UPLC-Q-TOF-MS技術共鑒定了藥材中的9個色譜峰，包括了3個生物堿類和6個黃酮類成分，其中峰7、峰8分別為R型或S型的N-glcindoleacectic Acid，峰9為木蘭花堿，峰12為Isospinosin，峰13為斯皮諾素，峰20為6'''-pcoumaloylspinosin，峰21為6'''-feruloylspinosin，峰22、峰23分別為R型或S型6''-O-（3-glc-indoleacetyl）spinosin。見表2。由于斯皮諾素色譜峰的保留時間適中且分離度良好，并且是酸棗仁主要的活性成分，所以確定以斯皮諾素為參照峰（S），計算其它色譜峰的相對保留時間及相對峰面積。19批酸棗仁藥材和5批理棗仁藥材的相對峰面積結果見表3。

圖1 酸棗仁、理棗仁和酸棗仁對照藥材的UPLC指紋圖譜比較Figure 1 Com parison of the UPLC finger-prints of Semen ZiziphiSpinosae，Semen ZiziphiMauritianae and reference sam ple of Semen ZiziphiSpinosae

表2 相關色譜峰的指認[12，13]Table 2 Identification of the related chromatographic peaks

2.5.2 酸棗仁藥材及理棗仁的UPLC指紋圖譜相似度分析 由圖1可知酸棗仁與理棗仁藥材的指紋圖譜較為相似，說明酸棗仁與理棗仁的化學成分較為相似，與文獻報道的較為相似[7，8]。因此，需要進一步對酸棗仁與理棗仁進行鑒別。將收集于不同產地的18批酸棗仁藥材和5批理棗仁藥材樣品的UPLC指紋譜圖數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件，以酸棗仁對照藥材為參照圖譜并計算24批藥材的相似度。結果顯示酸棗仁藥材的相似度較高，均大于0.97，而理棗仁藥材的相似度較低，均小于0.90。見表4。

2.5.3 酸棗仁及理棗仁的UPLC指紋圖譜聚類分析及主成分分析 將收集于不同產地的18批酸棗仁和5批理棗仁藥材樣品的相對峰面積導入IBM SPSSStatistics 19.0軟件進行聚類分析及主成分分析。聚類分析結果顯示，24批樣品可明顯分為2大類，見圖2-A。山西、河北、山東、遼寧等產地的酸棗仁藥材聚成一大類，且產地差異不明顯，對照藥材與山西運城的S1樣品聚為一小類，推測山西運城的酸棗仁藥材質量優于其他產地。此外，收集于不同地區的理棗仁藥材聚為一類，說明理棗仁藥材質量的相似性，可能均為同一個品種或來源于同一個產地。另外，編號為S8的酸棗仁與理棗仁聚為一大類，推測S8批次酸棗仁藥材可能為偽品或者摻偽品。PCA得分圖見圖2-B，可以發現24批樣品主要分為2組，來自道地產區的酸棗仁分為Ⅰ組，理棗仁分為Ⅱ組，因此主成分分析能夠有效區分酸棗仁與理棗仁，與相關研究結論較為相似[11]。另外編號為S8、S10兩批酸棗仁的分布介于酸棗仁與理棗仁之間，可以推測S8、S10為偽品或者摻偽品，與聚類分析結果互為一致。結果表明，聚類分析和主成分分析能夠明顯區分酸棗仁和理棗仁，并且還可以推測部分酸棗仁為偽品或者摻偽品。

2.5.4 酸棗仁藥材的UPLC指紋圖譜建立 結合前期相似度分析、聚類分析及主成分分析結果，排除推測為摻偽品的2批樣品和對照藥材后，將第Ⅰ組16批樣品的酸棗仁UPLC色譜圖依次導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件，建立酸棗仁藥材的對照指紋圖譜，結果顯示酸棗仁藥材具有26個共有峰。見圖3、4。

表3 19批酸棗仁藥材和5批理棗仁藥材的相對峰面積Table 3 The related peak area of 19 batches of Semen ZiziphiSpinosae sam p les and 5 batches of Semen Ziziphi Mauritianae sam ples

表4 19批酸棗仁和5批理棗仁的相似度結果Table 4 Sim ilarity of19 batches of Semen Ziziphi Spinosae sam ples and 5 batches of Semen Ziziphi Mauritianae sam p les

圖2 不同產地酸棗仁和理棗仁的聚類分析圖（A）和PCA得分圖（B）Figure 2 The cluster analysis（A）and principal com ponentanalysis（B）results of Semen Ziziphi Spinosae samp les and Semen ZiziphiMauritianae sam p les from differenthabitats

圖3 16批不同產地酸棗仁藥材UPLC指紋圖譜疊加圖Figure 3 The overlaying graph of UPLC finger-printof 16 batches of Semen ZiziphiSpinosae sam p les from differenthabitats

圖4 酸棗仁藥材UPLC對照指紋圖譜Figure 4 The reference UPLC finger-printof16 batches of Semen ZiziphiSpinosae samples from differenthabitats

3 討論

本課題組前期實驗對酸棗仁藥材進行了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、稀乙醇及70%乙醇等溶劑考察，結果以70%甲醇提取色譜峰數目較多、峰形較好且溶劑效應較小，故本研究選擇70%甲醇為溶劑。結合文獻研究，前期實驗選取了204、335、254 nm等波長進行對比研究，結果204 nm波長下的色譜圖基線漂移，335 nm波長下的峰信息較少，以波長為254 nm的色譜圖基線平穩且峰信息容量較大，故本研究選擇254 nm波長。另外，本研究選取了乙腈—水、乙腈—0.05%乙酸、乙腈—0.05%甲酸等流動相進行對比，結果顯示以乙腈—水為流動相的色譜圖部分色譜峰拖尾嚴重，以乙腈—0.05%甲酸為流動相的色譜圖分離效果最佳。

酸棗仁道地產區或主要產區主要為冀、魯、晉、陜等地。由于酸棗仁的用量較大，市場價格持續上漲，漸漸出現以理棗仁替代酸棗仁的現象。理棗仁為《中華人民共和國藥典》酸棗仁項下未收錄的品種，是市場用量較小、價格便宜的地方習用品。其外觀與酸棗仁相似，主成分差別不大。本研究通過相似度評價、聚類分析和主成分分析表明，采集于不同地方的理棗仁與酸棗仁的區別明顯，凸顯出來不同基源的品種差異性，為鑒定酸棗仁的真偽提供了科學依據。另外，來自不同道地產區或主產區酸棗仁的相似度較高，說明酸棗仁藥材質量總體差異不大，可為企業選址購買藥材及指導GAP建設提供科學性的建議。

本研究結果發現，酸棗仁藥材UPLC指紋圖譜具有26個共有峰，以LC-MS鑒定了其中的9個色譜峰，包括3個生物堿類和6個黃酮類成分，各批次酸棗仁藥材所含成分基本一致，相似度極高。本研究建立了能快速評價酸棗仁質量的UPLC指紋圖譜方法，可為酸棗仁藥材質量控制提供科學的新方法。