MALDI-TOF MS用于耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌同源性分析的研究*

徐建民，蔣 虔，楊 哲，李好蓮，姜 錚，宋世平，袁順宗，尹秀云，陳建魁

(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心/原解放軍第307醫(yī)院檢驗科，北京 100071)

越來越多碳青霉烯類抗菌藥物耐藥菌株的出現(xiàn)使臨床針對感染治療的形勢愈發(fā)嚴峻[1]。碳青霉烯類抗菌藥物耐藥機制與細菌的生物被膜形成，外膜孔蛋白丟失合并β內(nèi)酰胺酶的過度表達，或菌株表達碳青霉烯酶相關(guān)[2-6]。產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的重要機制[7]。該酶的編碼基因主要位于轉(zhuǎn)座子、整合子、質(zhì)粒等可移動的基因單元上，從而導致耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)可以通過垂直或水平方式快速出現(xiàn)及傳播[6]。臨床上治療CRKP感染的手段極其有限，一般只能采取患者隔離或?qū)ψ≡涵h(huán)境采取消毒等措施[8]。因此，快速準確的對CRKP進行同源性分析，及時有效的溯源對控制院內(nèi)感染尤為重要。

多位點序列分型(MLST)是通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增管家基因片段并進行序列分型，根據(jù)其序列型(ST)結(jié)果進行同源性分析?？赏ㄟ^網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)室間數(shù)據(jù)共享及比對，數(shù)據(jù)分析簡便快捷、可比性強、能直接對臨床標本進行分析[9]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)用于微生物快速鑒定是近年來的研究熱點，它是利用MALDI-Biotyper 3軟件構(gòu)建發(fā)育樹對其進行同源性分析，具有快速、準確、重復性好的特點，在國內(nèi)臨床微生物實驗室已得到較好地應(yīng)用[10]。

筆者以MLST分型方法獲得的同源性結(jié)果為標準[11]，對MALDI-TOF MS獲得的同源性分析結(jié)果進行評價，探索MALDI-TOF MS對耐藥肺炎克雷伯菌同源性分析在臨床實驗室應(yīng)用的準確性和可行性。

1 材料與方法

1.1CRKP菌株 菌株的來源分布、MLST分型引物序列、擴增條件及擴增產(chǎn)物結(jié)果處理方法，參照筆者前文[9]。

1.2方法 將95株CRKP接種于哥倫比亞血平皿上，放入溫度為35 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用滅菌竹簽挑取單個菌落，少量菌體均勻涂布在靶板孔位上，室溫下晾干。加1 μL 70%甲酸溶液均勻涂覆在樣本上，室溫下晾干。再加1 μL IVD HCCA基質(zhì)溶液均勻覆蓋在待測樣本上，室溫下晾干。將加樣完成的待測靶板放入MicroflexTM質(zhì)譜儀，進行上機檢測。利用MicroflexTM質(zhì)譜儀配套軟件MALDI Biotyper RTC進行蛋白質(zhì)指紋峰圖譜的采集。結(jié)果評價分數(shù)判斷標準：2.0分以下為匹配一般，2.0～<2.3分為匹配較好，2.3～3.0分為匹配好；并將蛋白質(zhì)指紋峰譜圖導入MALDI-Biotyper 3軟件進行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1指紋圖譜獲得 95株CRKP鑒定得分均超過2.3，結(jié)果為匹配好，表明獲得的蛋白指紋圖譜較完整，可以進行聚類分析，見表1。

表1 95株CRKP MALDI-TOF MS鑒定得分詳表

2.2質(zhì)譜聚類分析結(jié)果 首先通過MicroflexTM質(zhì)譜儀的分析軟件Flexanalysis獲得蛋白質(zhì)指紋峰信息，再將蛋白質(zhì)指紋峰譜圖導入MALDI-Biotyper 3軟件進行聚類分析。從聚類分析圖中可發(fā)現(xiàn)：95株菌可分為Ⅰ、Ⅱ 2個大類，Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅱa、Ⅱb 五個亞類，95株CRKP聚類分析樹狀圖中，可以直觀的發(fā)現(xiàn)Ⅰ類中Ⅰb和Ⅰc亞類親緣關(guān)系較近，Ⅰa亞類與Ⅰb、Ⅰc亞類親緣關(guān)系較遠；Ⅱ類中Ⅱa和Ⅱb亞類親緣關(guān)系較近。見圖1。

圖1 95株CRKP蛋白峰聚類分析圖

表2 MLST、MALDI-TOF MS結(jié)果與來源科室分布

注：其余為Q1、Q3、Q6～8、Q12～17、Q19～20、Z1～23、Z25～31、N1～30、I1～17

2.3質(zhì)譜聚類分析與MLST分型結(jié)果的比較 筆者之前的研究中[9]，MLST分型結(jié)果顯示：Q2號菌株為ST1型，Z24號菌株序列為ST15型，Q4為ST1198型，Q5為ST152型，Q9為ST1030型，Q10為ST2260型，Q11為ST1254型，Q18為ST2928型，另外87株CRKP的MLST分型均為ST11型。利用在線分析軟件eBURST V3對上述MLST結(jié)果進行分析，結(jié)果最終顯示ST2260和ST11為同一克隆型，ST1、ST15、ST152、ST1030、ST1198、ST1254、ST2928為單個型。證明其中88株菌株親緣關(guān)系近，另外7株菌親緣關(guān)系較遠。本研究中，MALDI-TOF MS聚類分析結(jié)果卻將95株CRKP分為了2大類，5個亞類。與MLST結(jié)果相比較后，發(fā)現(xiàn)87株ST11型分布在各亞類中，Q4、Q5、Q9、Q11分布在Ⅱa；亞類中Q10、Q18分布在Ⅱb亞類中；Q2、Z24分布在Ⅰb亞類中。見表2。

3 討 論

MALDI-TOF MS 鑒定基于細菌表達的蛋白質(zhì)峰的特征及豐度，通過分析待測菌體蛋白質(zhì)峰圖與模式菌蛋白質(zhì)峰圖之間的相似處，進而得到鑒定結(jié)果[12]。蛋白質(zhì)由遺傳基因物質(zhì)決定，相對分子質(zhì)量較大，性質(zhì)相對穩(wěn)定，MALDI-TOF MS通過分析同菌種間的細微差異，可以對細菌進行進一步分型[13]。其實驗特點是簡單、快速，可在幾分鐘內(nèi)通過MALDI-Biotyper 3獲得聚類分析及主成分圖。近來有國內(nèi)學者研究證明[14-17]，MALDI-TOF MS聚類分析可以對常見致病菌及耐藥菌進行同源性分析。

國內(nèi)學者謝思[18]對53株CRKP進行MLST和MALDI-TOF MS同源性分析發(fā)現(xiàn)，兩種方法結(jié)果相近，學者認為MALDI-TOF MS的結(jié)果比MLST結(jié)果能更詳細的展示各菌株之間的親緣關(guān)系。MENCACCI等[19]采用MALDI-TOF MS對35株泛耐藥鮑曼不動桿菌進行同源性分析，結(jié)果與重復序列PCR的分型結(jié)果基本相符，學者認為在未獲得基因分型結(jié)果前，MALDI-TOF MS 可以用來對耐藥菌暴發(fā)感染的提前判斷。

筆者之前的研究中[11]，MLST分型結(jié)果顯示：Q10為ST2260型，Q2號菌株為ST1型，Z24號菌株序列為ST15型，Q5為ST152型，Q4為ST1198型，Q9為ST1030型，Q11為ST1254型，Q18為ST2928型，其余87株CRKP的MLST分型均為ST11型。eBURST V3對以上MLST結(jié)果進行進一步分析，最終結(jié)果顯示ST2260和ST11為同一克隆型，ST1、ST15、ST152、ST1030、ST1198、ST1254、ST2928，7株為單個型。結(jié)果顯示1株ST2260和87株ST11，共88株菌株親緣關(guān)系近，另外7株菌親緣關(guān)系較遠。而MALDI-TOF MS聚類分析結(jié)果卻將95株CRKP分為了兩大類，5個亞類，兩種方法結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)，Q2、Z24分布在Ⅰb組中；Q4、Q5、Q9、Q11分布在Ⅱa組中；Q10、Q18分布在Ⅱb組中，其余87株ST11型各亞類中均有分布。

研究結(jié)果顯示，MicroflexTM質(zhì)譜儀聚類分析結(jié)果與MLST分型結(jié)果并不完全一致，原因分析：MLST的分型原理是從基因分子層面對細菌進行分析，雖然該方法檢測了7對管家基因，但對于分析含有大量基因組序列插入或缺少某些基因組序列詳細信息的菌株存在一定的局限性；MALDI-TOF MS聚類分析原理基于蛋白質(zhì)的表達及其表達豐度，然而臨床分離自CRKP受到抗菌藥物選擇壓力、感染位置、分離培養(yǎng)環(huán)境等因素的影響，其某些菌體蛋白可能過表達或不表達。使其蛋白峰圖產(chǎn)生差別，從而導致進一步聚類分析時產(chǎn)生誤差。與國內(nèi)外部分學者的研究結(jié)果相比較，筆者實驗結(jié)果與前者部分研究結(jié)果并不完全相符?？赡芘c研究中的標本量比前者的實驗標本數(shù)量更多，來源科室更多有關(guān)系。如此一來，MALDI-TOF在CRKP同源性分析方面的應(yīng)用還需要更深入的研究。SACHSE等[20]研究對比了MALDI-TOF、MLST及隨機引物擴增DNA多態(tài)性分析三種同源性分析方法，結(jié)果顯示，三種方法之間結(jié)果并不完全一致。該學者認為，MALDI-TOF MS應(yīng)用于臨床需要更多、更進一步的研究證實。

4 結(jié) 論

從本實驗結(jié)果上看，雖然MALDI-TOF MS聚類分析能夠?qū)?5株CRKP親緣關(guān)系顯示的比較直觀清晰，但是該方法廣泛應(yīng)用于臨床菌株同源性分析還需要更深入的實驗研究。