宮頸癌外周血中的長鏈非編碼RNA表達及其臨床意義

譚長安 程 靜

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，每年新增宮頸癌病例接近百萬，且有顯著年輕化的趨勢[1]。尋找理想的腫瘤標志物，能促進該病的早期診治、預后評估及指導個體化治療，從而改善患者的預后[2]。現(xiàn)代研究顯示宮頸癌的形成并非只由基因突變本身導致，表觀遺傳學修飾及其后調控基因表達水平的變化都可導致宮頸癌的發(fā)生[3]。而隨著功能基因組學的發(fā)展，非編碼轉錄產物的研究與檢測得到了廣泛應用。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度超過200個堿基的非編碼RNA(ncRNA)，其可在RNA 聚合酶Ⅱ的催化作用下進行轉錄與剪切修飾，但是不編碼蛋白[4-5]。lncRNA參與細胞功能及機體代謝過程，與胚胎發(fā)育、蛋白質編碼基因調控、細胞增殖凋亡、干細胞的分化、腫瘤細胞的放化療敏感性等都有一定的相關性[6-7]。lncRNA可影響結直腸癌、乳腺癌、肝癌[8]、非小細胞肺癌[9]等腫瘤細胞的增殖、轉移侵襲等生物學過程。已有學者研究顯示7%的lncRNA與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，lncRNA的異常表達能抑制宮頸癌細胞的增殖、克隆形成能力[10-11]。但是都為從單個lncRNA分析，沒有從組學方面進行綜合分析。本文具體探討了宮頸癌外周血中的長鏈非編碼RNA表達及其臨床意義，希望為宮頸癌的臨床早期診斷和預后判斷提供新的標志物。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年2月到2018年1月在我院經病理學確診的宮頸癌患者71例為病例組，選擇同期在門診進行常規(guī)體檢的健康婦女71例為對照組。納入標準：臨床與檢測資料完整；病例組檢測高危型人乳頭瘤病毒陽性，宮頸癌臨床分期為ⅠB～ⅡA；對照組宮頸薄層細胞學檢測高危型人乳頭瘤病毒陰性；年齡20～60歲。排除標準：合并感染性疾病以及肝、腎疾病患者；妊娠與哺乳期婦女；合并內分泌疾病、自身免疫性疾病患者。病例組中年齡最小24歲，最大54歲，平均年齡(46.39±2.22)歲；平均體重指數(shù)(22.88±1.47)kg/m2；平均病程(4.11±1.84)年。對照組中年齡最小22歲，最大56歲，平均年齡(46.11±1.48)歲；平均體重指數(shù)(22.32±2.48)kg/m2。2組入選者的年齡、體重指數(shù)對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此項研究是經我院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 外周血樣本的制備

抽取2組入選者的靜脈血各4 ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內，于取血后2 h內進行淋巴細胞分離。將血液樣本混勻后，3 500 r/min離心10 min，加入2倍體積的無菌PBS混合，然后加入室溫平衡的8 ml淋巴細胞分離液中，以1 500 r/min離心20 min后，取中層的白細胞。再于-4 ℃下10 000 r/min離心5 min后于-80 ℃冰箱保存。

1.3 基因芯片分析

使用Trizol試劑提取2組外周血的總RNA，采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進行檢測RNA完整性，使用AgilentRNA 6000 Nano Kit檢測組織總RNA經紫外分光光度計測定波長為260 nm和280 nm時的吸光度(A)值，比值為1.80～2.10者納入研究。逆轉錄成cDNA，使用Cy3-dCTP標記對照組，Cy5-dCTP標記病例組。選用晶芯4×180k lncRNA V3.0檢測芯片(博奧生物有限公司)，實驗步驟參考芯片實驗過程說明，實驗過程由公司協(xié)助完成。采用LuxScan3．0圖像分析軟件對芯片圖像進行分析，以差異為4倍的標準來確定差異表達基因。

1.4 實時熒光定量PCR

本研究對芯片檢測的差異表達基因進行了實時熒光定量PCR驗證，故選用GAPDH作為內參照，進行標準化處理，最終得到的比值為樣品待測基因的相對值。在NCBI上查詢lncRNA編號，下載得到lncRNA序列，利用primer3軟件進行引物設計，有大連TAKARA公司合成，引物序列見表1。

表1 lncRNA引物序列

1.5 統(tǒng)計方法

選擇SPSS 22.00軟件對本研究的計量數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)報告采用均數(shù)±標準誤，對比為t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 芯片體系情況

在本研究的芯片體系中，寡核苷酸芯片的外標、內標等陽性對照信號正常，陰性對照檢測為陰性；漏點率不超過0.3%，平均背景值與噪音值較低，檢測體系可靠，無影響數(shù)據(jù)的污染。

2.2 表達差異分析

與對照組相比，病例組患者外周血中有差異表達基因12個，其中表達下調的基因有9個，下調倍數(shù)為(11.43±1.48)；表達上調的基因有3個，上調倍數(shù)為(7.43±1.22)。見表2。

2.3 實時熒光定量PCR驗證結果對比

隨機挑選了4個基因進行實時熒光定量PCR驗證，其檢測結果與芯片檢測的結果是一致的。見表3。

3 討論

宮頸癌在我國已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題，在女性生殖道腫瘤中高居第一位，并且發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢[12]。當前該病診治的最迫切的要求是缺乏早期診斷和判斷預后的可靠指標。在組成人類基因組的幾十億個堿基對中，只有1%～2%的DNA序列可編碼成蛋白質，而非蛋白質編碼序列占絕大多數(shù)。其中80%的基因組序列能夠被轉錄成RNA，不過lncRNA占據(jù)基因組序列的50%左右[13]。

表2 癌外周血中的長鏈非編碼RNA表達差異分布

表3 實時熒光定量RCR驗證結果對比

lncRNA是調控非編碼RNA中的一種，為不具有編碼蛋白質功能的細胞內轉錄產物。lncRNA具有空間和時間特異性，可在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平調節(jié)基因的表達，參與機體基因轉錄激活與干擾、基因組印跡、X染色體失活、染色質修飾與重塑、核內運輸、X染色體失活等多種生物學過程的調控，可在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14-15]。基因芯片技術是當前研究lncRNA表達的主要技術之一，具有覆蓋全面、靈敏、準確、高效的特點[16]。有學者對12例腎癌組織及其癌旁正常組織進行差異表達譜分析，得到916個差異表達的lncRNAs，且上調的lncRNAs比下調的lncRNAs顯著減少[17]。本研究采用的4×180k lncRNA V3.0檢測芯片是目前涵蓋lncRNA序列最全面的芯片之一，不但包括眾多l(xiāng)ncRNA數(shù)據(jù)庫最新版本，還包括當前最新的848條中等長度的非編碼RNA。本研究芯片檢測結果顯示與對照組相比，病例組患者外周血中有差異表達基因12個，其中表達下調的基因有9個，下調倍數(shù)為(11.43±1.48)；表達上調的基因有3個，上調倍數(shù)為(7.43±1.22)。當前有研究顯示lncRNA可能調控著人乳頭瘤病毒的致癌過程，可降低或增強致癌過程中調控靶基因、靶蛋白的表達，從而阻斷或促進病變進展[18]。還有學者應用基因芯片技術對12例宮頸癌癌灶及其相應癌旁組織樣本進行l(wèi)ncRNAs差異分析，發(fā)現(xiàn)14個lncRNAs表達顯著下調，18個lncRNAs表達顯著上調[19]。

當前腫瘤治療面臨的挑戰(zhàn)主要是發(fā)現(xiàn)癌癥異常表達的特定基因，并明確這些差異基因的功能。近些年發(fā)現(xiàn)的與宮頸癌促癌作用相關的lncRNAs主要有H19、EBIC、Linc-P21等[20]，與宮頸癌抑癌作用有關的lncRNAs主要有XLOC_010588等，改變其表達水平對宮頸癌的增殖、侵襲等生物學行為有顯著的影響[21]。本研究隨機挑選了4個基因進行實時熒光定量PCR驗證，其檢測結果與芯片檢測的結果是一致的。KLF2、KLF6可共同調控EN02基因的表達，該基因定位于12號染色體，其為一種低氧應力蛋白，也為一種糖酵解酶的二聚體，可以通過增加無氧代謝提高腫瘤細胞對低氧環(huán)境的耐受性，其過度表達與惡性腫瘤的預后有顯著相關性[22]。KLF8、KLF3可參與調控人類核仁素基因，其產物為核仁磷酸蛋白，可參與核糖體的合成和成熟過程，主要位于核仁中密集的原纖維區(qū)域[23-24]。有研究表明核仁素可通過減弱視網膜母細胞瘤基因、p53基因的功能而減弱細胞的凋亡過程，從而在宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展過程中起到調控作用[25]。同時本研究的基因差異表達譜與相關報道重合率較低，主要的原因可能在于本研究采用的樣本為外周血，而非組織樣本，且選擇的年齡比較集中。不過本研究也有一定的局限性，本研究為小樣本的研究，存在一定的研究偏倚，將在下一步進行深入分析。

總之，lncRNAs基因芯片是檢測宮頸癌外周血差異表達基因的一種高通量、高效、快速的檢測手段，KLF2、KLF6、KLF8、KLF3可能是潛在的基因治療靶點。