布魯氏菌BP26蛋白的原核表達及鑒定

魯友銘,李俊萱，吳勝昔，曾 政，黃 恒，李令臣，侯力嘉

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054；2.重慶市動物疫病預防控制中心， 重慶 401120)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人畜共患病，也是世界上流行性最廣、危害最大的一種人畜共患病。布魯氏菌是一種胞內寄生的革蘭氏陰性菌，因其可以感染人類與其他60余種哺乳動物，導致宿主出現流產、發熱、關節性損傷等患病特征，對發展中國家畜牧業帶來巨大的經濟損失。近期我國頒布多項政策與法律以達到對布魯氏菌病的及時防控[1-2]。早期、快速、準確地診斷該病是防控與凈化該病的關鍵。現有的布魯氏菌病的實驗室診斷技術標準主要包括虎紅平板凝集試驗(RBT)、全乳環狀試驗(MRT，僅限于乳牛)、試管凝集試驗(SAT)、補體結合試驗(CFT)、抗人球蛋白試驗(AGT,僅限于人)、間接酶聯免疫吸附測定(IELISA)、競爭酶聯免疫吸附測定(CELISA)、補體結合酶聯免疫吸附測定(CF-ELISA)、膠體金技術(GICT)、熒光偏振試驗(FPA)以及各類核酸診斷技術等[3]。其中RBT、MRT僅限于布魯氏菌的初步篩選。而以SAT為典型的傳統血清學試驗存在假陽性與假陰性的現象，無法區分人工免疫以及自然感染。ELISA為主的新型免疫學與分子生物學診斷技術各具特色，但都存在一定的局限性[4]。外膜蛋白是布魯氏菌的主要毒力因子，其通過干擾巨噬細胞抗原呈遞活性，促使布魯氏菌逃離宿主的免疫反應，從而在宿主中大量增殖[5]。BP26(Omp26)蛋白是布魯氏菌的優勢蛋白，是一種具有強免疫原性的外膜蛋白，也是目前普遍采用的基因敲除候選蛋白。在感染的動物血清當中均可找到BP26蛋白的單克隆抗體的存在[6-7]。BP26蛋白可以引起宿主細胞的炎性反應，具有一定的細胞毒性作用[8]。

本次課題通過原核表達的方式，純化出了純度及濃度較高的BP26蛋白，為后續布魯氏菌病的檢測提供了有效試劑及為布病疫苗的研發奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)由上海唯地生物科技有限公司提供；質粒載體pET28a(+)由重慶理工大學生生物制藥實驗室保存并提供；布魯氏菌BP26質粒、 DH5α甘油菌由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并提供。

1.2 主要試劑及儀器

卡那霉素(Kanamycin)、IPTG，PMSF購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；質粒提取試劑盒購自北京博邁德基因技術有限公司；蛋白質分子質量標準購自安諾倫(北京)生物科技有限公司；5×Loading buffer購自上海碧云天生物技術有限公司；HRP-羊抗小鼠IgG購自武漢三鷹生物技術有限公司；Monoclonal anti-HIS Tag antibody購自美國SIGMA公司；NdeI、Xhol I、10×Q.Cut.G.Buffer購自TAKARA生物技術(北京)有限公司；MULTISKAN GO購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；NGCTMChromatography System、Bio-ScaleTM親和層析Ni柱均購自美國Bio-Rad公司;Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀購自美國GE公司。

1.3 序列分析、合成

根據GenBank發表的布魯氏菌BP26基因序列 (GenBank登錄號： U45996)，對序列分析后進行大腸桿菌宿主密碼子優化，使其適用于大腸桿菌表達系統，質粒載體選擇pET30a(+)。交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并構建。

1.4 pET30a(+)-BP26重組載體的酶切鑒定

將轉化后的pET30a(+)-BP26/BL21(DE3)進行甘油保菌。

1.5 重組載體的轉化

將重組質粒pET30a(+)-BP26通過熱激法轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，具體操作步驟參考文獻[9]。

余蔭山房中植物景觀元素類型豐富，既有本地品種，也有外來品種，其中喬木24種，灌木24種，集中分布于前庭院和周圍，與園中建筑相得益彰。“深柳堂”前炮仗花為園主親手種植，干粗如樹，形如盤龍繞住，在春節前后花朵盛開時狀如串串炮竹，呈現“紅雨”視覺景觀[10]。旱庭中的南洋杉為西方的樹種，引自大洋洲，與余蔭山房中的幾何水池、拱形門窗、彩色玻璃相互映襯。“來熏亭”一側的木菠蘿冠幅寬大，葉色濃綠亮澤，宛如綠云遮蓋，極富嶺南風情[11]。“玲瓏水榭”東側對植桂花，除了追求秋季盛開時花香滿園的嗅覺感受外，更加象征了園主家族“一門三舉人，父子同折桂”的崇高榮譽。

用接種環蘸取少量DH5α甘油菌，在含有卡那霉素抗性LB平板上劃線接菌，置于37℃恒溫培養箱進行過夜培養。挑取單菌落提取質粒。將提取出的質粒利用Nde I、Xhol I限制性核酸內切酶進行雙酶切，37 ℃水浴條件下酶切1 h。之后將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.6 pET30a(+)-BP26重組蛋白的表達與鑒定

取出保藏好的甘油菌進行平板劃線，挑取單菌落于LB液體培養基中培養數小時。當菌液OD600 nm值達到0.8時，加入適量的IPTG，于37℃誘導數小時。取誘導后的菌液沉淀進行SDS-PAGE電泳鑒定。

趙雪梅 女，1989年9月出生于遼寧省阜新市，2012 年于遼寧工程技術大學獲得學士學位，2017年于遼寧工程技術大學獲得博士學位，現于中國科學院遙感與數字地球研究所做博士后研究工作，主要研究方向為遙感圖像分割及基于深度學習的Landsat圖像分類.

1.7 pET30a(+)-BP26重組蛋白的誘導表達條件篩選

1) 設置IPTG的濃度為1 mmol/L，誘導時間為6 h。設置16、25、37 ℃這3組溫度變量。所得菌液經過SDS-PAGE電泳，結果如圖3所示，表明重組蛋白的最佳誘導溫度為37 ℃。

1.8 pET30a(+)-BP26蛋白的大量表達及純化

按照本文1.7節確定的最佳誘導條件，利用200 mL LB液體培養基對轉化菌進行搖床培養與誘導。對于誘導后的菌液按照包含體純化的方法進行處理。利用Bio-Rad公司的NGCTMChromatography System對處理后的樣品進行親和層析。詳細操作步驟見文獻[10]。

1.9 重組蛋白pET30a(+)-BP26 的Western Blot鑒定

設置了誘導溫度、IPTG濃度及時間3個影響因素對重組蛋白pET30a(+)-BP26進行最佳誘導條件的優化。探索出其最佳誘導條件為：37 ℃，1mmol/L IPTG,誘導8 h。

2 結果與分析

2.1 酶切結果

酶切結果見圖1。

傅向升指出，華誼集團傳承歷史、弘揚傳統，激勵斗志、振奮精神，不忘初心、勇擔責任，在新形勢下華誼集團要提高思想站位、擴大開放合作、加快自主創新、推動轉型發展。

M:DNA分子質量標準；1：pET30a(+)-BP26經Nde I、Xhol I雙酶切上樣

2.2 重組蛋白pET30a(+)-BP26的誘導表達鑒定

2) 在37 ℃條件下，設置了不同的IPTG濃度進行相同時間誘導，所得菌液經過SDS-PAGE電泳分析，結果如圖4所示。結果表明：重組蛋白在37 ℃，IPTG誘導濃度為1 mmol/L時，蛋白表達量最高。

M.蛋白質分子質量標準; 1.未經IPTG誘導上清; 2.未經IPTG誘導沉淀; 3.加入IPTG誘導上清; 4.加入IPTG誘導沉淀; 5.空載體pET30a(+)誘導上清; 6.空載體pET30a(+)誘導沉淀

圖2 重組蛋白pET30a(+)-BP26的鑒定

2.3重組蛋白pET30a(+)-BP26誘導條件的優化

將純化后的目的蛋白pET30a(+)-BP26進行SDS-PAGE電泳，然后將目的條帶利用濕轉法轉移至PVDF膜上，以5%的脫脂奶粉進行封閉。以Monoclonal anti-HIS Tag antibody為一抗(1∶4 000)，4 ℃孵育過夜，第2天于水平搖床孵育2 h。將PVDF膜放入TBST中清洗3次，每次10 min。以羊抗鼠IgG-HRP為二抗(1∶4 000)37 ℃水平搖床孵育1 h，再將PVDF膜放入 TBST洗3次，每次10 min，加入顯色液(A液+B液)孵育5 min，最后用Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀進行化學發光成影。

藥品流通集團型企業一般經濟實力雄厚，商業誠信度較高，通常在多地設有全資（控股）子公司，各個子公司在其所在地有較好的業務優勢。藥品生產企業從減少自身風險的角度出發，通常愿意與此類企業合作，使得此類企業更容易獲得藥品配送權。由于集團內部向全資（控股）子公司或全資（控股）子公司之間調撥藥品可不視為“一票”，藥品在集團型企業中的流轉更為便利，貨源更為充足，有利于下游業務的拓展，從而形成良性循環。在“兩票制”的大環境下，此類企業更容易進一步做大做強。

將pET30a(+)-BP26質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，挑取單菌落接種于5 mL卡那霉素抗性試管中，37 ℃恒溫搖床培養至菌液OD600 nm值達到0.8。將各試管按IPTG濃度梯度(0.1、0.5、1 mmol·L-1)、溫度梯度(16、25、37 ℃)以及時間梯度(4、6、8 h)進行誘導篩選。將樣品進行SDS-PAGE電泳分析確定最佳誘導條件。

M.蛋白質分子質量標準；1.未誘導對照；2. 16 ℃誘導表達沉淀；3. 16 ℃誘導表達上清；4. 25 ℃誘導表達沉淀；5. 25 ℃誘導表達上清；6. 37 ℃誘導表達沉淀；7. 37 ℃誘導表達上清; 8.空載體沉淀; 9.空載體上清

圖3 誘導溫度的優化

將經pET30a(+)-BP26和pET30a(+)轉化的重組菌株在相同誘導溫度、相同IPTG劑量、相同誘導時間進行誘導表達，超聲破菌，分別取沉淀和上清與適量的1× PBS溶解，煮樣10 min，然后進行SDS-PAGE電泳檢測。結果表明：重組菌株在未加入IPTG誘導時，目的蛋白具有少量的表達，在經過IPTG誘導后，表達量會有一定的增加，而空載體對照沒有相應條帶出現(27.8 kDa處),見圖2。這與預期分子量大小相一致，說明重組蛋白pET30a(+)-BP26成功進行了表達。

M:蛋白質分子質量標準；1.未誘導沉淀；2.0.1mmol/L IPTG誘導沉淀；3.0.1mmol/L IPTG誘導上清4.0.5mol/L IPTG誘導沉淀；5.0.5mol/LIPTG誘導上清；6.1mmol/L IPTG誘導沉淀；7.1mmol/L IPTG誘導上清

圖4 IPTG濃度的優化

3) 在37 ℃條件下，IPTG誘導濃度為1 mmol/L，設置了不同的誘導時間，所得菌液經過SDS-PAGE電泳分析，結果如圖5所示。結果表明：BP26重組蛋白在37 ℃，IPTG誘導濃度為1 mmol/L，誘導8 h蛋白表達量最高。

沒有找到工作的同學都來向李麗請教，李麗說是自己運氣好，可這樣的借口哪能打發得了同學們，最后李麗被纏得實在沒有辦法了，只好說出了自己的秘密：

M:蛋白質分子質量標準；1.未經誘導菌液沉淀；2.誘導4 h菌液沉淀；3.誘導4 h菌液上清；4.誘導6 h菌液沉淀；5.誘導6 h菌液上清；6.誘導8 h菌液沉淀；7.誘導8 h菌液上清

圖5 誘導時間的優化

2.4 目的蛋白pET30a(+)-BP26的純化以及SDS-PAGE鑒定

采用Ni柱親和層析的方法對經過尿素變性后的目的蛋白進行純化，用不同濃度的咪唑(50、100、200、400、500 mM)對目的蛋白進行梯度洗脫，收集280 nm紫外吸收峰的洗脫液。結果顯示：200 mmol/L咪唑可以將目的蛋白全部洗脫下來。

1批性狀不符合規定，其余白礬樣品均符合規定。不符合規定樣品的性狀為無味，與標準規定的“氣微、味酸、微甘而極澀”不符。對不符合規定樣品進行含量測定項檢驗，含量測定結果表明該樣品含水硫酸鋁鉀含量極低，為0.4%，標準規定含水硫酸鋁鉀不得少于99.0%，涉嫌造假。為此，在探索性研究工作中對其成分進行了分析和鑒定。

將純化后的目的蛋白經SDS-PAGE電泳鑒定，結果如圖6所示。

M.蛋白質分子質量標準；1.BP26純化蛋白；2.BP26- pET30a(+)/BL21(DE3)原菌液3.pET30a(+)/BL21(DE3)原菌液

圖6 純化后的目的蛋白pET30a(+)-BP26 SDS-PAGE鑒定

2.5 目的蛋白pET30a-BP26的Western Blot鑒定

Western Blot顯示在27.8 kD處有明顯的蛋白印跡出現(見圖7)，與預期的結果一致，說明已經成功表達出目的蛋白。

1.重組蛋白pET30a(+)-BP26；2.pET30a(+)空載體對照

3 討論

布魯氏菌是一種動物病原體，可引起人布魯氏菌病。雖然布魯氏菌作為一種偶發宿主感染人類，但每年仍有50萬例新的人類感染案例，而且尚未有對病人有效的治療方案或批準的人類疫苗的報告。布魯氏菌對淋巴細胞和生殖系統具有很強的組織趨向性，其在人體細胞內的生活方式限制了先天和適應性免疫反應對其抗原表位的暴露，從而導致免疫系統無法識別病原菌，所以人患布魯氏菌病在很多情況下是一種終生疾病[11]。BP26蛋白是布魯氏菌病的一種很好的診斷抗原，可用于驗證性試驗，并可用于天然感染和人工疫苗接種的血清學鑒別，所以BP26蛋白的制備對于布魯氏菌病的診斷以及治療具有關鍵作用[12]。到目前為止，前人研究共發現7種布魯氏菌外膜蛋白，而25～27 k、31～34 k、36～38 k這3種是菌體表面最主要的外膜蛋白，而BP26蛋白則屬于25～27 k這一種屬[13]。Cloeckaert等使用cELISA對布魯氏菌外膜蛋白與陽性血清特異性反應進行了分析，總結得出外膜蛋白10 k、16.5 k、19 k、25～27 k、36～38 k都可以檢測出陽性血清，所以BP26蛋白作為布病的檢測抗原具有可行性基礎[14]。有學者將BP26蛋白與Omp10蛋白聯合運用在布病的血清學檢測當中，對檢測的靈敏性與特異性都有了一定的提高，并且可以區分自然感染與人工免疫，對布病檢測技術的研究具有重要的意義[15]。本實驗利用原核表達系統大量制備目的蛋白BP26，避免了化學合成目的蛋白的高成本以及真核表達系統的長周期、表達量少、造價高等缺點[16]。純化后的目的蛋白是與His6多肽、S·Tag、Thrombin site、Enterokinas site結合形成的融合蛋白，且重組蛋白是以包涵體的形式存在于宿主細胞中，這一點符合重組基因在原核表達系統的一般規律[17]。本次實驗成功制備出了目的蛋白BP26包涵體，對接下來的BP26單克隆抗體的制備以及布魯氏菌病的快速檢測具有重要的意義。