勿色桿菌和假單胞菌對原油降解特征對比＊

徐榮德 萬云洋，3 陳踐發(fā) 王曉梅 蘇 勁

(1.中國石油大學(北京)地球科學學院；2.油氣資源與探測國家重點實驗室；3.油氣污染防治北京市重點實驗室；4.中國石油勘探開發(fā)研究院)

0 引 言

在原油的開采、儲運過程中，油品的泄漏通常會造成土壤污染，石油烴類污染已成為石油石化行業(yè)土壤污染的主要形式之一。在眾多石油烴污染土壤的修復方法中，微生物修復法具有高效率低成本、無二次污染、應用范圍廣泛及不破壞生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點，已成為土壤修復的主流技術之一[1-2]。

已報道原油降解菌共約100余屬200多種，尚缺針對革蘭氏陰性菌(G-)和革蘭氏陽性菌(G+)石油烴降解的系統(tǒng)對比研究。其中G-假單胞菌屬(Pseudomonas)和G+勿色桿菌屬(Achromobacter)[3]均為較常見的原油降解菌[4-6]。以往的部分報道認為，假單胞菌屬對原油降解效率更高[7-8]，且對苯、萘及熒蒽等高分子量多環(huán)芳烴有較強的降解能力[9-11]，而勿色桿菌屬對原油的降解效率相對偏弱，但有較寬的烷烴降解譜[12]。

本文通過從勝利油田油污土壤中分離篩培出的純菌黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)和勿色桿屬菌種(Achromobatersp)在實驗室條件下模擬土壤環(huán)境中原油微生物降解。首次分析原油降解氣組分變化特征并結合降解油族組分及飽和烴生物標記化合物特征，對比分析G+和G-的降解特征，為原油烴類污染土壤的微生物修復提供理論依據(jù)與技術參考。

1 材料與方法

1.1 原油樣品及菌種來源

原油樣品取自塔里木油田TH13-C井未遭受生物降解的海相原油，飽和烴組分含量約為69%，芳烴含量25.8%。菌種來自勝利油田現(xiàn)場油浸土壤，以原油為唯一碳源，經(jīng)富集和選擇性培養(yǎng)獲得的原油降解菌。降解菌經(jīng)分離獲得兩株純菌，經(jīng)鑒定分別為革蘭氏陽性勿色桿屬菌種(Achromobatersp) SLTHX114株和典型原油降解耗氧革蘭氏陰性黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214株。培養(yǎng)基配置及菌種富集如下[13]：

1)配制液體培養(yǎng)基。取酵母膏0.5 g、胰朊胨1.0 g、NaCl 0.5 g置于200 mL錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水配得液體培養(yǎng)基。平均分配到兩個100 mL錐形瓶中后封口并高溫高壓滅菌30 min左右。

2)石油降解菌搖菌。待培養(yǎng)基滅菌完畢冷卻至室溫，然后分別向兩個錐形瓶中接入SLTHX114株和SLTHX214株兩種石油降解菌。使菌濃達到109個/mL，于4℃下保存。

1.2 原油生物降解模擬實驗

將油氣運聚地球化學示蹤物理模擬子系統(tǒng)的管線轉換成并聯(lián)模式，清洗高壓管并干燥，微生物降解模擬實驗示意見圖1。用蒸餾水將已經(jīng)過酸堿處理過的石英砂反復沖洗后置于馬弗爐內干燥。取適量石英砂和40 mL原油充分攪拌混合后平均裝于4個高壓管中并編號M1、M2、M3和M4號。向M1和M2號高壓管中各加入20 mL石油降解菌SLTHX114株，向M3和M4號高壓管中各加入20 mL石油降解菌SLTHX214株。最后在M1號和M3號高壓管中各加入20 mL微生物營養(yǎng)液[14]。密封高壓管，常壓、溫度調節(jié)至40℃。每隔1周通空氣并在第4周和第8周分別收集原油降解氣及中間降解原油樣品，對氣體組分、油樣族組分、飽和烴色質進行定量分析。同時設置M0作為空白對照樣。接種SLTHX114株并加入營養(yǎng)液的高壓管發(fā)生泄漏導致M2號實驗數(shù)據(jù)無效。

圖1 微生物降解模擬實驗示意

1.3 GC-MS、GC-FID分析

氣體組分分析使用美國Vasson公司的US10917013-7890A型微量氣相色譜儀，每次進樣2 mL。檢測條件：進樣溫度為200℃，檢測器(FID)溫度310℃，氣體分析溫度為50℃，運行時間20 min；以氦氣為載氣，流速1 mL/min[15]。

降解的油水混合物進行油水分離，用正己烷沉淀瀝青質，然后用硅膠-氧化鋁柱色層分離出飽和烴、芳烴和非烴。

飽和烴色質分析用TRACE GC ULTRA色譜儀，連接Thermo DSQII質譜儀，使用30 m長、HP-5型、直徑0.25 mm、膜厚0.25μm的毛細管柱。He作為載氣，1 cm3/min恒流。程序升溫：50℃恒溫5 min；50～220℃，4℃/min；220～320℃，2.0℃/min；320℃恒溫25 min，氣化室溫度300℃。

2 結果與討論

對空白對照樣M0接種SLTHX114株的M1、接種SLTHX214株，并加入微生物營養(yǎng)液的M3以及接種SLTHX214株的M4模擬樣品進行第4周降解氣組分、第4周及第8周原油族組分以及相關生標化合物變化特征分析。

2.1 降解氣組分變化特征

微生物在對原油降解過程中常伴隨著CO2的產生[16]。本模擬實驗中，隨著降解時間的增加，第4周取得模擬氣樣組分特征如圖2所示。接種兩種原油降解菌SLTHX114株和SLTHX214株的模擬實驗過程中所產生的降解氣CO2含量均較高(18.26%～90.51%)。對比兩種原油降解菌模擬實驗降解氣組分差異，發(fā)現(xiàn)接種SLTHX214株的M3和M4降解氣中CO2表現(xiàn)出高異常現(xiàn)象(分別為87.36%和90.51%)，而烴類組分相對較低。而接種SLTHX114株的M1中CO2含量(18.26%)遠低于接種SLTHX214株的氣樣，而烴類組分(C2～C5)含量相對較高，表明菌株SLTHX214對原油的降解能力相對更強。

注：M1為接種勿色桿菌并加入微生物營養(yǎng)液；M3為接種黃色假單胞菌并加入微生物營養(yǎng)液；M4為接種黃色假單胞菌；M0為空白對照樣。圖2 兩種原油降解菌模擬實驗降解氣組分對比

2.2 原油族組分變化特征

微生物降解原油各組分的難易程度一般為：飽和烴>芳烴>膠質和瀝青質，其中芳烴具有數(shù)量龐大、結構獨特、機理復雜等特征[17-18]，且其溶解性強，遷移能力高，會對土壤及地下水造成較大危害[19]。

通過模擬實驗第4周和第8周降解原油與原始油樣族組分對比分析見圖3，降解原油中芳烴組分明顯降低，飽和烴、非烴和瀝青質含量相對增加，其中飽和烴含量變化較非烴和瀝青質小，表明兩種原油降解菌對原油中飽和烴和芳烴均有降解，但芳烴組分降解具有相對優(yōu)勢。對比兩種降解菌在模擬第4周降解原油的族組分含量差異，M3和M4樣品中芳烴組分含量(分別為17.8%和13.8%)低于M1(20.3%)，而飽和烴含量較高，表明菌株SLTHX214對芳烴的降解強度和速率可能高于菌株SLTHX114，體現(xiàn)出不同菌株對原油的降解作用具有速度效應。隨著降解時間的增加，第8周測得的3個模擬油樣的各族組分含量趨于穩(wěn)定，菌株SLTHX114對原油的降解程度達到與菌株SLTHX214相同的效果。對比不同降解時間M3和M4原油族組分的變化特征，第4周M4樣品中芳烴組分含量明顯低于M3，至第8周兩者各組分趨于相同，表明營養(yǎng)液對微生物降解原油啟動有協(xié)助作用，隨著降解時間的增加，降解速率趨于穩(wěn)定。

注：M0為原始油樣；M1為接種勿色桿菌加入微生物營養(yǎng)液；M3為接種黃色假單胞菌并加入微生物營養(yǎng)液；M4為接種黃色假單胞菌；M1-2、M3-2和M4-2為降解第8周原油。圖3 兩種原油降解菌模擬實驗第4周和第8周降解油族組分對比

2.3 生物標志化合物評價原油降解程度

生物標志化合物是原油中相對較難被微生物降解的一類化合物，因不同化合物對微生物降解的敏感性存在差異，因此常被用來評價原油微生物降解程度。本文對飽和烴主要生物標志物——正構烷烴、類異戊二烯烴和萜類化合物進行了對比分析。

通過對原始油樣及生物降解原油的生物標志化合物參數(shù)對比見表1，接種兩種菌株的降解原油生標參數(shù)Pr/nC17、Ph/nC18和(Pr+Ph)/(nC17+nC18)較原始樣品明顯增大，表明正構烷烴已被微生物降解至一定閾值，并開始與類異戊二烯烴同時被消耗。降解原油中Pr/Ph比值遠小于未降解油，表明姥鮫烷對生物降解作用較植烷更敏感，降解速率更大，這與文獻報道一致[20]。兩種菌株對原油降解的不同階段，上述參數(shù)均未表現(xiàn)出明顯差異。但通過比值參數(shù)C30αβH/(Pr+Ph)變化特征來看，隨著降解時間增大，該參數(shù)表現(xiàn)出顯著增大的特征，且在兩種菌株之間也表現(xiàn)出較大的差異。接種菌株SLTHX114的降解油樣該參數(shù)在降解不同階段均相應的高于接種菌株SLTHX214的降解油樣，表明菌株SLTHX114對飽和烴降解更具優(yōu)勢，且兩種菌株對原油的降解等級已達到4級降解。

表1 不同原油降解菌不同時間降解原油中主要生物標志參數(shù)對比

另外，與前人研究成果相反的是，兩種菌株降解原油的伽馬蠟烷指數(shù)及Ts/Tm參數(shù)隨生物降解而表現(xiàn)出降低的趨勢。因此，在嚴重生物降解原油油源對比，沉積環(huán)境分析及成熟度評價時，上述參數(shù)均不可用。

3 結 論

綜上所述，革蘭氏陰性的黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214對原油的降解能力和效率強于革蘭氏陽性的勿色桿屬菌種(Achromobatersp)SLTHX114。兩種原油降解菌均優(yōu)先降解原油中芳烴組分，黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214對芳烴的降解能力相對高于勿色桿屬菌種(Achromobatersp)SLTHX114，而勿色桿屬菌種(Achromobatersp)SLTHX114對原油中飽和烴組分的降解能力相對強于黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214，不同菌種對原油不同組分具有選擇性和互補性。自然生態(tài)環(huán)境中，G+和G-不是單獨存在的，其合理菌群的構建，可為原油烴類污染土壤的微生物修復提供理論依據(jù)與技術參考。對上述兩種原油降解菌的降解機理和土壤降解效率還在進一步研究中。