雙黃連顆粒HPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識(shí)別分析

高利利 倪健 于穎超 黃平情 龐琳諾 曾亞文 秦有文 韓賡 尹興斌

摘要：目的? 建立雙黃連顆粒HPLC指紋圖譜并進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別，為其質(zhì)量評價(jià)提供方法。方法? 樣品經(jīng)50%甲醇提取后，采用HPLC進(jìn)行檢測，以甲醇-0.2%磷酸水為流動(dòng)相梯度洗脫，流速0.8 mL/min，檢測波長278 nm，柱溫30 ℃。以對照品及單味藥指認(rèn)共有峰，確定制劑藥物的來源歸屬;對30批樣品進(jìn)行相似度評價(jià)、聚類分析及主成分分析。結(jié)果? 雙黃連顆粒指紋圖譜中確定25個(gè)共有峰，通過對照品指認(rèn)出13個(gè)峰。30批樣品與對照指紋圖譜的相似度為0.827～0.981，聚為兩大類。第一主成分貢獻(xiàn)率為70.919%，已指認(rèn)成分有木犀草素、連翹苷、異綠原酸A、黃芩苷、漢黃芩素;第二主成分貢獻(xiàn)率為10.835%，已指認(rèn)成分有隱綠原酸、4，5-O-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、新綠原酸、連翹脂素、綠原酸。結(jié)論? 本研究建立的指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可用于雙黃連顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：雙黃連顆粒;高效液相色譜法;指紋圖譜;相似度評價(jià);聚類分析;主成分分析

中圖分類號：R284.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0060-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.014????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To establish the HPLC fingerprint of Shuanghuanglian Granules and chemical pattern recognition; To provide a method for its quality evaluation. Methods The sample was extracted with 50% methanol and detected by HPLC， methanol-0.2% phosphoric acid as mobile phase with gradient elution; the flow rate was 0.8 mL/min; the detection wavelength was 278 nm; the column temperature was 30 ℃. According to the comparison of reference substances and single medicinal materials， the common peaks was identified， and the source of the preparation-medicinal materials was determined. Similarity evaluation， cluster analysis and principal component analysis were performed on 30 batches of samples. Results Totally 25 common peaks were identified in the fingerprint of Shuanghuanglian Granules， and 13 peaks were identified by reference substances. The similarity between the 30 batches of samples and the reference fingerprint ranged from 0.827 to 0.981， forming two types. The contribution rate of the first principal components was 70.919%， which identified components were luteolin， forsythin， isochlorogenic acid A， baicalin and wogonin. The contribution rate of the second principal components was 10.835%， which identified components were cryptochlorogenic acid， 4，5-O-dicaffeoylquinic acid， isochlorogenic acid B， neochlorogenic acid， forsythiaside and chlorogenic acid. Conclusion The established fingerprint method is stable， reliable and reproducible， which can be used for the quality control of Shuanghuanglian Granules.

Keywords： Shuanghuanglian Granules; HPLC; fingerprint; similarity evaluation; cluster analysis; principal component analysis

雙黃連顆粒由金銀花、黃芩、連翹組成，收載于2015年版《中華人民共和國藥典》（一部），具有疏風(fēng)解表、清熱解毒功效，用于外感風(fēng)熱所致感冒，癥見發(fā)熱、咳嗽、咽痛[1]。研究表明，方中金銀花主要含有機(jī)酸類、黃酮類、三萜皂苷類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分，其中綠原酸、咖啡酸、槲皮素、木犀草苷等是抗流感病毒作用的主要活性成分[2];黃芩中的黃芩苷、黃芩素等黃酮類成分具有明顯的抗炎解熱及抗病毒作用[3];連翹主要含有苯乙醇及其苷類、木脂素類、黃酮類成分，對多種細(xì)菌及病毒具有一定的抑制作用[4]。2015年版《中華人民共和國藥典》對雙黃連顆粒中黃芩苷和連翹苷含量進(jìn)行了限量要求[1]，目前研究多集中在指標(biāo)成分定性定量及指紋圖譜[5-7]，尚缺乏全面穩(wěn)定可行的質(zhì)量控制方法。

中藥指紋圖譜具有“模糊性”和“整體性”的特點(diǎn)，能夠比較全面反映化學(xué)成分的種類和數(shù)量，表征中藥復(fù)雜成分與其內(nèi)在質(zhì)量之間的關(guān)系，在2015年版《中華人民共和國藥典》有廣泛應(yīng)用[8]。化學(xué)模式識(shí)別是化學(xué)計(jì)量學(xué)的重要組成部分，是篩選中藥質(zhì)量標(biāo)志物的重要數(shù)學(xué)方法，在中藥指紋圖譜中的運(yùn)用日益增多[9-10]。本試驗(yàn)建立雙黃連顆粒HPLC指紋圖譜，以對照品及單味藥指認(rèn)共有峰，確定制劑藥物的來源歸屬;對所收集的30批不同廠家不同批次樣品進(jìn)行相似度評價(jià)、聚類分析和主成分分析，為更好、更全面地控制該產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1? 儀器與試藥

Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），YP 5002型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司），MS105 DU型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），SB-5200 DTD型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

綠原酸（批號110753-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以99.3%計(jì)）、4，5-O-二咖啡酰奎寧酸（批號111894-201102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以94.1%計(jì)）、黃芩苷（批號110715-201720，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以93.5%計(jì)）、漢黃芩苷（批號112002- 201702，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以98.5%計(jì)）、黃芩素（批號111595- 201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以98.5%計(jì)）、漢黃芩素（批號111514-201706，供鑒別用）、連翹苷（批號110821- 201615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以94.9%計(jì)）、木犀草素（批號111520-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以99.6%計(jì)），中國食品藥品檢定研究院;新綠原酸（批號B21396，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、隱綠原酸（批號B21587，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、異綠原酸B（批號B21540，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、異綠原酸A（批號B21539，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、連翹脂素（批號B20726，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%），上海源葉生物科技有限公司。金銀花、黃芩、連翹由北京春風(fēng)藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定，分別為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花、唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根、木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果實(shí);甲醇為色譜純（美國Fisher公司），水為娃哈哈純凈水。30批雙黃連顆粒樣品來源信息見表1。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 色譜條件

采用Thermo Acclaim 120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，15%～25%A;10～15 min，25%～28%A;15～25 min，28%～35%A;25～35 min，35%～45%A;35～65 min，45%～60%A;65～80 min，60%～85%A），流速0.8 mL/min，檢測波長278 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2? 溶液制備

2.2.1? 供試品溶液

取本品，研細(xì)，取約1.2 g/0.6 g（無蔗糖），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，加50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2? 混合對照品溶液

精密稱定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、4，5-0-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、連翹苷、連翹脂素、木犀草素對照品適量，加50%甲醇制成含綠原酸49.3 μg/mL、新綠原酸51.6 μg/mL、隱綠原酸45.6 μg/mL、4，5-0-二咖啡酰奎寧酸45.5 μg/mL、異綠原酸B 52.0 μg/mL、異綠原酸A48.0 μg/mL、黃芩苷45.3 μg/mL、漢黃芩苷48.9 μg/mL、黃芩素49.6 μg/mL、漢黃芩素48.0 μg/mL、連翹苷54.7 μg/mL、連翹脂素54.8 μg/mL、木犀草素42.8 μg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.2.3? 單味藥供試品溶液

按處方比例分別稱取各單味藥粉末（過4號篩），精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3? 方法學(xué)考察

2.3.1? 精密度試驗(yàn)

取雙黃連顆粒樣品（S2），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以4號色譜峰為參照，經(jīng)計(jì)算得到各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均小于0.1%，相對峰面積RSD均小于3.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.2? 重復(fù)性試驗(yàn)

取雙黃連顆粒樣品（S2）6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以4號色譜峰為參照，經(jīng)計(jì)算得到各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均小于0.1%，相對峰面積RSD均小于3.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取雙黃連顆粒樣品（S2），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以4號色譜峰為參照，經(jīng)計(jì)算得到各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均小于0.1%，相對峰面積RSD均小于3.7%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4? 指紋圖譜的建立

取30批雙黃連顆粒，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。將得到的S1～S30圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行分析，以S2圖譜作為參照，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.2，經(jīng)多點(diǎn)校正后全譜峰匹配，生成對照指紋圖譜，見圖1。根據(jù)檢測所得圖譜，確定25個(gè)共有峰。選擇保留時(shí)間適中、分離度較好的4號峰作為參照峰（S）。30批雙黃連顆粒指紋圖譜見圖2。

2.5? 共有峰的歸屬與指認(rèn)

分別取各單味藥供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，1、3、4、5、7、8、9、10、11、12號峰來源于金銀花，7、15、16、17、18、19、21、22、23、24、25號峰來源于黃芩，2、3、6、7、8、11、13、14、20號峰來源于連翹。通過與混合對照品圖譜對比，指認(rèn)1號峰為新綠原酸，4號峰為綠原酸，5號峰為隱綠原酸，9號峰為異綠原酸B，10號峰為異綠原酸A，12號峰為4，5-0-二咖啡酰奎寧酸，13號峰為連翹苷，16號峰為黃芩苷，18號峰為木犀草素，19號峰為漢黃芩苷，20號峰為連翹脂素，22號峰為黃芩素，24號峰為漢黃芩素，見圖3。

2.6? 相似度分析

30批雙黃連顆粒樣品與對照指紋圖譜的相似度為0.827～0.981，S1～S13與對照指紋圖譜的相似度為0.910～0.981，S14～S30與對照指紋圖譜的相似度為0.827～0.979，見表2。表明所建立的對照指紋圖譜特征性較強(qiáng)，不同廠家、不同批次樣品間存在一定差異，可能為生產(chǎn)過程中因操作人員或操作工藝參數(shù)不同導(dǎo)致。

2.7? 化學(xué)模式識(shí)別

2.7.1? 聚類分析

運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，以25個(gè)共有色譜峰相對峰面積數(shù)據(jù)為變量，Z標(biāo)準(zhǔn)化后，以平方Euclidean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用Ward法對30批雙黃連顆粒樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果表明，類間距介于5～25時(shí)，30批樣品聚為兩大類，S1～S13聚為一類，S14～S30聚為一類，見圖4。

2.7.2? 主成分分析

運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，以25個(gè)共有色譜峰相對峰面積數(shù)據(jù)為變量，特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到前4個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為91.520%，見表3。根據(jù)主成分載荷矩陣（見表4），確定第一主成分中載荷量較大的13個(gè)變量，分別為21、8、6、23、18、25、7、13、10、17、16、3、24號峰，表明第一主成分主要反映了這些成分的信息，其中18號峰為木犀草素，13號峰為連翹苷，10號峰為異綠原酸A，16號峰黃芩苷，24號峰為漢黃芩素;同理，第二主成分主要反映了2、5、12、9、1、20、4號峰這7個(gè)成分的信息，其中5號峰為隱綠原酸，12號峰為4，5-0-二咖啡酰奎寧酸，9號峰為異綠原酸B，1號峰為新綠原酸，20號峰為連翹脂素，4號峰為綠原酸。以4個(gè)主成分（PC1～PC4）所對應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率占所提取主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率的比例作為權(quán)重，計(jì)算主成分綜合模型為Y=0.774 9PC1+0.118 4PC2+0.055 0PC3+0.051 7PC4，通過模型計(jì)算每個(gè)樣本的綜合得分，按分值高低對樣本進(jìn)行排序，結(jié)果見表5。

3? 討論

中藥指紋圖譜應(yīng)以盡量多檢測出樣品的有效成分、洗脫盡量多的色譜峰，且分離度良好為指標(biāo)。本試驗(yàn)分別考察了50%甲醇、甲醇提取溶劑及30、45 min超聲提取時(shí)間對提取效果的影響，結(jié)果表明，以50%甲醇為提取溶劑，超聲30 min即可。本試驗(yàn)比較了甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.25%冰乙酸、甲醇-0.4%磷酸、乙腈-水和乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)對指紋圖譜的影響，結(jié)果甲醇-0.2%磷酸流動(dòng)相系統(tǒng)所得指紋圖譜中各色譜峰的分離情況和峰形較好。通過DAD檢測器在190～400 nm進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在278 nm波長處色譜峰多，可代表的信息較全面，色譜峰基線平穩(wěn)且各色譜峰分離較好，因此選擇278 nm作為指紋圖譜的采集波長。本試驗(yàn)考察了3種不同型號的色譜柱Acclaim 120 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），各組分在3種型號色譜柱中出峰順序一致，分離情況差別不大，綜合分離度、拖尾因子等因素，最終選擇Acclaim 120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。試驗(yàn)比較了流速分別為0.8、1.0 mL/min所得圖譜，結(jié)果流速為0.8 mL/min時(shí)所得指紋圖譜中各色譜峰分離較好。

雙黃連顆粒中黃芩苷成分含量較高，在相似度計(jì)算時(shí)權(quán)重較大，但指紋圖譜間的細(xì)微差異可能才是質(zhì)量評價(jià)的關(guān)鍵。在黃芩苷峰參與積分的條件下，30批雙黃連顆粒指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度均在0.997以上，而在黃芩苷峰不參與積分的條件下，相似度在0.827～0.981，能反映出差異。因此在相似度計(jì)算中，可通過屏蔽強(qiáng)峰積分的方法，更好地體現(xiàn)不同廠家、不同批次樣品間的質(zhì)量差異。這種屏蔽強(qiáng)峰的相似度評價(jià)方法對于化學(xué)成分差異細(xì)微的藥材及制劑有很好的鑒別意義[11]。

聚類分析常用于數(shù)據(jù)的初步探索性分析，有直觀、結(jié)論形式簡明的優(yōu)點(diǎn);主成分分析為雙線性模型方法，利用方差最大原則，對原始數(shù)據(jù)所包含的多個(gè)自變量進(jìn)行線性擬合，以新的低維變量代替原始高維變量，即主成分，主成分之間互不相關(guān)，從而使這些主成分能夠反映原始變量的絕大部分信息，且所含的信息互不重疊，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維[12]。本試驗(yàn)以30批雙黃連顆粒指紋圖譜的25個(gè)共有色譜峰相對峰面積數(shù)據(jù)為變量，進(jìn)行聚類分析和主成分分析，結(jié)果可將樣品聚為兩類，與樣品來源廠家一致。第一主成分貢獻(xiàn)率為70.919%，主要反映了13個(gè)峰的信息，已指認(rèn)成分有木犀草素、連翹苷、異綠原酸A、黃芩苷、漢黃芩素;第二主成分貢獻(xiàn)率為10.835%，已指認(rèn)成分有隱綠原酸、4，5-0-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、新綠原酸、連翹脂素、綠原酸。研究結(jié)果提示，指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分含量測定能更全面評價(jià)雙黃連顆粒的質(zhì)量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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（收稿日期：2019-01-18）

（修回日期：2019-02-15;編輯：陳靜）