常見豬病診斷中口腔液樣品采集及注意事項(xiàng)

陳善真葉 平王貴平 饒 雷賓 梅馮彥君 林顯站陳海輝曹仁祺*

（1廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東廣州 511400；2桂林聯(lián)勤保障中心第二儲備資產(chǎn)管理局，廣西桂林 541000；3陽西縣豐沃生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，廣東陽江 529800）

口腔液具體指唾液、齒齦分泌物、口腔部創(chuàng)傷分泌物、食物和水的混合物等，其中包括上皮細(xì)胞和黏膜細(xì)胞、微生物、酶、其他生物活性分子。采集口腔液具有無創(chuàng)、省力、快速、應(yīng)激少、避免公豬傷害、費(fèi)用低、無需訓(xùn)練采樣技巧、擴(kuò)大采集樣本數(shù)量等優(yōu)勢[1]。在人醫(yī)上采集口腔液已經(jīng)用于診斷口腔疾病和消化系統(tǒng)性疾病，目前已經(jīng)從人的口腔液中鑒定出23種病毒和14種病原菌與全身感染性疾病有關(guān)，這些病毒包括皰疹病毒、肝炎病毒、HIV等[2]。

在獸醫(yī)領(lǐng)域，前蘇聯(lián)最早將馬的口腔液用于疾病監(jiān)測。在豬病方面，1976年Corthier首先將豬的口腔液用于豬瘟的檢測，對于豬的常見疾病，如非洲豬瘟（ASF）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）、豬圓環(huán)病毒2型病、流感病毒（IVA）感染、輸血傳播病毒（TTV1/2）感染、大腸桿菌病、鏈球菌病、豬肺炎支原體病等都可以通過口腔液做抗原或抗體檢測。此外，豬口腔液還可以用于早期診斷，一些傳染病的病毒性血癥在出現(xiàn)癥狀前，已經(jīng)存在于口腔液中，因此將口腔液用于診斷動物的疾病可以比血清樣品更早得到結(jié)果。

對每欄豬只采集口腔液是傳統(tǒng)的采血和采集病料的替代方案，尤其在豬群藍(lán)耳病的抗原和抗體檢測和監(jiān)測中應(yīng)用較多。Prickett等[3]發(fā)現(xiàn)豬口腔液和血液中的PRRSV抗原檢測一致性為77%；Graage等[4]通過對口腔液和血清的藍(lán)耳病病毒抗體檢測比較，也發(fā)現(xiàn)其一致性較高。此外，除了在豬群口腔液中可以做抗原檢測，也可以對單頭豬只的口腔液做抗體抗原檢測。Kittawornrat等[5]在單個公豬試驗(yàn)采樣中發(fā)現(xiàn)，口腔液相對于血清在檢測個體公豬PRRSV中更有優(yōu)勢，認(rèn)為其可以取代血清檢測。本文通過采集豬群口腔液對一些病毒的抗原進(jìn)行檢測，旨在為后期豬病的診斷提供更多思路。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

不同規(guī)格棉繩、剪刀、大自封袋、50mLEP管。

1.2 試驗(yàn)方法

豬口腔液采集的主要目的是讓盡量多的豬在短時(shí)間內(nèi)盡可能多地咀嚼棉繩。觀察豬在1 min內(nèi)咀嚼棉繩的次數(shù)，一般1頭豬咀嚼棉繩的時(shí)間超過20 s可認(rèn)為是豬—繩相互作用1次。

口腔液采集流程如下：

①將全棉繩吊系于豬舍的豬欄上，保育豬舍的棉繩以直徑1.3 cm為宜，育肥豬或生產(chǎn)公母豬豬舍的棉繩直徑以1.6 cm為宜；不同的飼養(yǎng)密度，懸掛的棉繩數(shù)量不同，如果一欄飼養(yǎng)豬只數(shù)量較少，可以懸掛較少的棉繩，如果一欄飼養(yǎng)豬只數(shù)量較多，可以懸掛較多的棉繩，以確保欄內(nèi)的每頭豬只都能咀嚼到棉繩，保證采集足夠的口腔液（圖1）；

②棉繩懸掛在遠(yuǎn)離食槽和排便的區(qū)域，上端固定，下垂高度與豬只的肩關(guān)節(jié)齊平，約70 cm高；

③吸引豬只咀嚼，30 min后收取棉繩；

④刮取和擠壓棉繩上的口腔液至1 L裝的自封袋內(nèi)，然后再將液體裝入50 mL EP管，一般認(rèn)為大于1 mL口腔液即為有效采集量。

2 影響口腔液采集的因素

2.1 豬群年齡

豬具有群體模仿探究一致性行為。對于肉豬來講，年齡越大的豬探究行為越強(qiáng)，但妊娠母豬和公豬對棉繩好奇心較差。試驗(yàn)表明，12～14周齡的豬在試驗(yàn)開始15 min后咀嚼棉繩比例明顯增加[6]。

2.2 豬群規(guī)模

在30 min內(nèi)，各年齡段豬只咀嚼比例平均為78.5%。豬群規(guī)模越大，咀嚼比例越低，其中存欄16～20頭豬的欄舍其豬只咀嚼棉繩的比例高于存欄20～26頭的欄舍和存欄26頭以上的欄舍[7]。

2.3 母豬限位欄

限位欄內(nèi)母豬平均咀嚼棉繩的時(shí)間為2 min 42 s，咀嚼棉繩時(shí)間大于2 min的影響因素主要包括稻草鋪的地板、大的棉拭子（270 cm2）和操作者[8]。

2.4 咀嚼時(shí)間

絕大多數(shù)的豬咀嚼時(shí)間超過20 s，加上前述78.5%的咀嚼比例，可以認(rèn)為采集的唾液樣品代表了此欄豬的感染狀態(tài)[9]。

2.5 咀嚼次數(shù)

絕大多數(shù)的豬咀嚼次數(shù)超過1次。

2.6 是否采食

在飼喂前采集豬的唾液樣品，豬由于好奇心，相對于采食后，咀嚼比例要高。

2.7 棉繩數(shù)量

每欄懸掛多于1條棉繩比1條棉繩咀嚼比例會增高。

3 討論

3.1 有部分豬不咀嚼棉繩

圖1 不同密度豬群采樣繩的懸掛

在豬群中，有些豬不會咀嚼棉繩，即使在棉繩上噴灑葡萄糖也無濟(jì)于事，其原因有待分析。在對群養(yǎng)母豬采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)欄，有大于40%的母豬咀嚼棉繩，最少的欄也有10%母豬咀嚼棉繩。有學(xué)者用群體采樣和單獨(dú)采樣法采集口腔液樣品與采集的血樣樣品進(jìn)行PRRSV的抗體比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)口腔液采樣特異性低于血樣，但5個口腔液混樣后可提高其抗體特異性。

3.2 采樣棉繩的準(zhǔn)備

國外具有現(xiàn)成的棉繩樣品（St.Josef產(chǎn)品）或者棉拭子或Geno tube（Thermo fisher產(chǎn)品），目前國內(nèi)杭州貝爾塔獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室有成套唾液采集樣品，或是網(wǎng)購。網(wǎng)購棉繩時(shí)盡量不選擇有染料棉繩，此類棉繩會添加染料，染料會對后續(xù)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)生干擾，甚至?xí)霈F(xiàn)假陽性結(jié)果。棉拭子可以采用人醫(yī)用的一次性滅菌棉拭子。

3.3 其他采樣方式的特點(diǎn)

部分疾病如ASF也可以用鼻拭子、口腔拭子、肛拭子和口腔液檢測，鼻拭子采樣時(shí)因?yàn)椴僮鳠o法確實(shí)，結(jié)果有時(shí)會受影響。口腔液檢測因?yàn)槭芏喾N唾液酶的影響，樣品采好后，需立刻冷藏保存運(yùn)輸，且在樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)立即檢測，避免當(dāng)一些病毒的核酸含量低時(shí)，核酸分解而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。以上何種檢測方法更敏感或更適合于疫病的早期診斷，還需要進(jìn)一步研究。

3.4 口腔液采集時(shí)的注意事項(xiàng)

①棉繩極具吸水能力，口腔液采集后需要及時(shí)將唾液擠出，否則時(shí)間過久，口腔液將無法擠出。②采集口腔液時(shí)，當(dāng)欄位數(shù)較多時(shí)，注意樣品間的交叉污染，同時(shí)注意標(biāo)記好每欄編號，以便回溯檢查。③口腔液因?yàn)槠渲锌乖蚩贵w含量較少，為避免其降解，需在采樣后盡快放置在冰箱，且采樣后要求24 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，并在實(shí)驗(yàn)室及時(shí)檢測。

4 小結(jié)

綜上所述，口腔液樣品的采集過程非常重要，僅當(dāng)有高質(zhì)量的樣品時(shí)，才會產(chǎn)生合格的檢測結(jié)果。隨著口腔液中病原DNA提取技術(shù)的改善和口腔液DNA檢測方法的進(jìn)一步完善，口腔液在豬病檢測上的用途會越來越廣泛。