某規模化豬場類NADC30 、HP-PRRSV、PRRSV 與大腸桿菌混合感染的診斷與防治

申歡歡，陽愛國，陳弟師，顏其貴

（四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130；四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041）

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)也稱豬藍耳病，是由動脈炎病毒科動脈炎病毒屬的豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種嚴重的病毒性傳染病。該病以引起母豬的繁殖障礙、仔豬和育成豬呼吸道癥狀及高死亡率為主要特征[1，2]。本病曾經在歐洲的德國、荷蘭、西班牙、比利時、英國、法國，美洲的墨西哥、智利，亞洲的韓國、日本都發生過，僅美國2005-2010 年PRRS 就 造 成 了6.64 億美元的損失，嚴重危害世界養豬業的發展[3，4]。在中國，由于對該病的認識和防控不到位，病毒與豬體之間的相互作用促進了病毒變異，導致了自2006 年以來暴發高致病性藍耳病（HPPRRSV），HP-PRRSV 的NSP2 區出現30 個AA 缺失，gp5 區域也發生了變異，對中國養豬業造成很大損失，但是有研究表明NSP2 區域的缺失并不是豬高致病性藍耳病毒力增強的根本原因[5，6]；自2013 年起我國出現變異株NADC30-like-PRRSV(NADC30)，NADC30 NSP2 區 域 出 現131 個AA缺失，gp5 區域也發生了變異[7,8]，進一步加重了PRRSV 的危害，該病有可能為輸入性疾病[9，10]。NADC30 毒株與高致病性藍耳病毒株和普通藍耳病相比，在基因組學和臨床致病性等方面均呈現出明顯差異，揭示了我國PRRSV 流行毒株出現了新的變異類型，更加加重了PRRSV 的危害[11]。

1 發病情況

豬場有繁殖母豬1 000 余頭，分別于2017 年9 月份和12 月份出現一定量的母豬流產。流產前幾天母豬體溫升高，食欲減退或不食，部分母豬有呼吸癥狀，腹部和耳部發紺，流產胎兒多數為死胎，胎兒大小一致無木乃伊胎，少數活仔豬大部分于6 d 內死亡。

2 病理解剖

病理解剖可見仔豬頜下淋巴結，腹股溝淋巴結和腸系膜淋巴結腫大有出血，心包有積液，心冠變軟，肺部組織實質性肉變，肺部病例切片顯示為典型間質性肺炎（圖1）。擠壓肺部切面會出現泡沫，腎臟有出血點。

3 實驗室檢測

3.1 PCR 檢測

根據發病情況和免疫程序首先考慮對豬場病料進行豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的檢測。應用Primer 5.0探針對NADC30(GenBank: KP860909.1)，JAX1（GenBank:EF112445.1）和CH-1a（GenBank:EF112445.1）為參考序列設計可同時鑒別NADC30，HP-PRRSV和PRRSV的引物PRRSV-F/R，PRRSV目的條帶約1 020 bp；HP-PRRSV目的條帶約940 bp；NADC30目的條帶約6 3 0 b p（P R R S V-F：TTTTGGACACCTCCTTTGATTG；PRRSV-R：TCTACGCTTGACAGG GAGCTGCTT）。PRV的檢測使用國標引物PRV-F/R，目的條帶約220 bp（PRV-F: CAGGAGGACGAG CTGGGGCT; PRV-R: GTCCACGCC CCGCTTGAAGCT）。取疑似發病豬只心，肝臟，脾，肺和腎等組織做勻漿處理；12 000 r/min離心5 min收集勻漿上清液；參照美基生物病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病料DNA/RNA，50 μL Nuclease free water 溶解核酸。取1 μL核酸參照TAKALA反轉錄試劑盒說明書反轉錄為CDNA。PRRSV 10 μL檢測體系：0.5 μL CDNA, 10 nmol/L上下游引物各1 μL，7.5 μL Nuclease free water。擴增條件為：98 ℃ 2 min, 98 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s（35循環），72 ℃ 5 min。PCR產物5 μL用 1%瓊脂糖凝膠進行鑒定（圖2）。PRV 10 μL檢測體系：0.5 μL DNA,10 n mol/L上下游引物各1 μL，7.5 μL Nuclease free water。擴增條件為：98 ℃ 2 min,98 ℃ 10 s,56 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s（35循環），72 ℃ 5 min。PCR產物5 μL用 1%瓊脂糖凝膠進行鑒定。

3.2 細菌檢測

3.2.1 細菌分離鑒定

無菌操作取發病豬心、肝、腎、脾等組織接種于含5%胎牛血清的胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養基，37 ℃培養36 h 可見直徑為1.5 mm 的圓形，光滑，表面濕潤，銀灰色的菌落。挑取單個菌落進行革蘭氏染色和油鏡下觀察，細菌形態為短桿菌，長約1 ～3 μm(圖3)。對分離細菌進行生化鑒定：分離細菌對硫化氫、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、黏液酸（鹽）、賴氨酸、鳥氨酸等反應管呈陽性，吲哚試驗呈陽性；VP 試驗陰性和枸櫞酸鹽利用呈陰性。生化鑒定結果符合大腸桿菌的特征[12]。

圖1 肺部病理切片

圖2 PRRSV 檢測

圖3 細菌鏡檢

4 分析討論

通過流行病學、剖檢結果和PCR 檢測可以初步判定該豬場為PRRSV、HP-PRRSV、NADC30 混合感染。該豬場24 個月前免疫過HPPRRS 疫苗，但是母豬流產情況并沒有得到很大的改善。也有報道免疫PRRS 后導致豬群感染PRRSV，這也是許多豬場做PRRS 免疫時的憂慮[13]。該規模化豬場發病豬體表發紅，有的出現體溫升高的情況；母豬流產胎兒大小差異不大，無木乃伊胎；剖檢可見淋巴結腫大有出血，肺部呈現典型間質性肺炎；腎臟有出血點；心包有積液但無纖維滲出。綜合以上情況初步判定可能會存在PRRSV 的感染。根據該豬場和NADC30 流行情況運用Primer 5.0 設計可同時擴增PRRSV 、HP-PRRSV、NADC30 引物；PCR 結果出現3 條帶大小分別為：1 020 bp、940 bp、620 bp。針對母豬流產情況研究室檢測了PRV 和PRRSV。檢測結果證實此規模化豬場存在PRRSV 、HPPRRSV、NADC30 混合感染，無PRV的感染。實驗室臟器細菌檢測結果顯示為大腸桿菌感染。該規模化豬場小規模流產診斷為：以PRRSV 、HP-PRRSV、NADC30 混合感染為主因所導致。

5 防治

針對病死豬深埋無害化處理，對豬場進行全面消毒，生活區與生產區分開，進入生產區前要洗澡換鞋，每棟豬舍前放置消毒燒堿水，盡量減少非必要人員和物料接觸。對引進后備豬進行隔離檢疫；對患病豬只進行隔離并檢測豬體情況，進行帶豬消毒；豬舍用消毒液消毒每周兩次常態化進行；加強豬舍通風和科學飼養管理；優化免疫程序并監測豬群整體狀態；及時淘汰老弱母豬。仔豬哺乳前用0.1%的高錳酸鉀擦洗母豬腹部；注意仔豬保溫和清潔。針對大腸桿菌感染于分娩前2 d 注射氧氟沙星預防處理；每天早晚各1 次。保持哺乳舍的干燥和清潔，保證仔豬保溫和干燥，可以提供保溫箱或者電熱毯。