種質資源超低溫保存技術及其在草莓中的應用研究進展

連朋 王麗娟

摘 ? ?要：植物種質資源是最重要的自然資源之一，也是植物育種的基礎。因此，研究植物種質資源保存技術對維持物種多樣性具有重要的現實意義。種質資源超低溫保存技術是指植物材料在液氮（-196 ℃）超低溫環境中可以長期保存，以保持其遺傳穩定性。本文對植物種質資源超低溫保存技術的起源、研究現狀、保存原理、具體方法、影響因素以及保存時間進行了歸納總結，并概述了其在草莓種質資源保存、脫毒苗培育及草莓再生苗遺傳穩定性方面的應用，提出其在發展的過程中凍存機理、材料凍存前后生理狀態和普適性技術體系方面的研究有待于進一步深入的觀點，并指出其在材料脫毒、抗性育種和遺傳轉化方面的廣闊發展前景，旨在為該技術在植物種質資源保存方面的深入研究和進一步拓展應用提供參考。

關鍵詞：種質資源;超低溫保存;草莓;研究進展

中圖分類號：S668.4; S325 ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.002

Abstract： ?Plant germplasm resources are one of the most important natural resources and the basis of plant breeding. Therefore， it is of great practical significance to study the conservation technology of plant germplasm resources to maintain species diversity. The cryopreservation technology of germplasm resources refers to the long-term preservation of plant materials in liquid nitrogen （-196 ℃） cryopreservation environment to maintain their genetic stability. In this paper， the origin， research status， preservation principle， specific methods， influencing factors and preservation time of cryopreservation technology for plant germplasm resources were summarized， and its application in preservation of strawberry germplasm resources， cultivation of virus-free seedlings and genetic stability of regenerated strawberry seedlings were summarized. It was pointed out that the research on freezing mechanism， physiological state and universal technical system of materials before and after freezing need to be further deepened， and that it had broad prospects for development in material detoxification， resistance breeding and genetic transformation. The paper is to provide reference for further research and application of this technology in plant germplasm conservation.

Key words： ?germplasm resources; cryopreservation; strawberry; research progress

植物種質資源是指包含各種遺傳物質的植物總稱，又被稱作遺傳資源或品種資源，包括栽培種、野生種和人工培育的各種植物的品種或品系[1]。隨著科學技術不斷進步，工業、農業、制造業需求不斷增長，人類掠奪式開采自然資源的方式嚴重威脅著植物種質資源的保存，目前全球有近十萬種植物（超過世界植物種類的1/3）瀕臨消失的邊緣，我國約有15%的植物瀕臨消失，并且全球氣候變暖使這種狀況更為惡化[2]。據估計，過去的3個世紀，物種絕跡速度被人為地提高了1 000多倍，大部分城市地區和栽培作物原產地的野生資源及其近緣種都瀕臨絕跡[3]。

植物種質資源保存方法分為3種：傳統保存法、離體保存法和超低溫保存法。傳統保存法分為原生境保存和異生境保存兩種[4]，可以較好地保存一些稀有或者即將滅絕的物種以及一些人們需求的特有物種，有助于人們對這些植物種質資源的開發和使用，但需要大量的土地和人力資源，消耗的成本較高，并且容易遭受各種病蟲害和自然災害的侵襲。離體保存法是利用植物細胞的全能性以及組織培養技術獲得細胞、組織、器官特定培養材料，通過改變培養材料生長的外部環境條件，使其生長速度降至最低限度，以達到保存種質的目的[5]，離體保存的材料不僅需要按期繼代，而且可能會發生染菌和褐化現象導致材料失活[6]，另外隨著培養時間的增加保存的材料可能會發生遺傳變異[7]。超低溫保存法一般是在液氮（-196 ℃）的超低溫條件下保存植物細胞、組織或器官，經過超低溫保存的植物材料能保持正常的細胞活性、全能性和遺傳穩定性，從而達到長時間保存種質資源的目的[8]。

本文主要從保存原理、研究現狀、具體方法、影響因素、保存時間幾個方面對植物種質資源超低溫保存技術進行歸納總結，并對其在草莓種質資源保存中的應用進行概括，旨在為該技術在植物種質資源保存方面的深入研究和進一步拓展應用提供參考。

1 種質資源超低溫保存技術

1.1 原理及現狀概述

植物種質資源超低溫保存指的是將植物的器官、細胞等材料置于液氮（-196 ℃）中使其始終處于超低溫的環境下進行保存的技術[9]。處于超低溫保存的植物材料暫停一切新陳代謝活動，經過解凍和恢復培養該材料再次具有正常細胞的生理活性和遺傳穩定性。在這一變化過程中，凍存的細胞內化學成分沒有發生本質性改變，僅在物理結構方面發生變化，不會改變細胞內遺傳物質以及相關代謝功能，因此在植物材料解凍后仍然能夠保持普通細胞的正常生理活性及遺傳穩定性，防止因長期繼代培育而造成的基因突變和染色體變異等，從而可以實現安全、有效的長期凍存植物材料[10]。

超低溫保存是目前唯一可以長期保存植物種質資源且不需要繼代培育的成本較低的技術，甚至被認為是實現植物種質資源長久、穩定保存的唯一途徑[11]。該技術的發展起源于對冷凍保護劑作用的了解，其保存過程中植物細胞需經歷劇烈的降溫和升溫變化，故超低溫保存成功的關鍵是避免降溫過程中細胞內冰晶生成以及溫度改變對細胞膜系統和代謝酶活性的影響[12]。1949年Polge發現甘油可以減輕超低溫對鳥類精子的凍存破壞，1959年二甲基亞砜（DMSO）開始被作為冰凍保護劑[13]。Nag等[14]于1973年首次報道了利用超低溫保存技術成功凍存蘿卜懸浮細胞的研究。自此以后，經過近四十年的探索和發展，從開始相對落后的快速降溫冷凍法、逐漸降溫冷凍法[15]，至1981年Fahy首次提出植物細胞玻璃化（即在比較慢的冷卻速率下利用高濃度的冷凍保護劑溶液使植物細胞進入玻璃化狀態）的概念[16]，提升發展為玻璃化法[17]、包埋玻璃化法[18]、小液滴玻璃化法[15]等，使超低溫保存技術日趨完善。截止到2018年，我國已建成1座國家種質資源長期庫、1座復份庫、10座中期庫及種質資源信息系統，保存48.1萬余份的種質資源，保存數量位居世界第二，為作物科學和遺傳育種提供了雄厚的物質基礎[19]。

1.2 方 法

目前，植物莖尖、芽和分生組織的超低溫保存方法主要有如下5種[20]。

1.2.1 慢凍法 也稱為二步冷凍法，以緩慢的速度連續降溫到-196 ℃，或者將材料以0.5～2.5 ℃·min-1的降溫速度持續降溫到-30～-40 ℃，然后再將莖尖直接浸沒液氮中;或者在-30～-40 ℃預凍一段時間，然后再將莖尖浸沒于液氮中。

1.2.2 快凍法 ? ?即在預處理溫度下，將材料徑直浸沒于液氮凍存。

1.2.3 包埋脫水法 ? ?首先是將材料用海藻酸鈣包埋，然后將包埋后的保存材料放在含有高濃度的培養基上進行預培養，之后用通風設備或硅膠對包埋小珠進行干燥脫水處理后投入液氮凍存。

1.2.4 玻璃化法 ? ?在材料經過預培養后，用高濃度的玻璃化液在常溫或0 ℃條件下進行加載處理和脫水處理，然后再將莖尖浸沒于液氮中凍存。

1.2.5 包埋玻璃化法 ? ?先是用海藻酸鹽包埋材料，然后用玻璃化液進行誘導脫水，最后將其直接浸沒于液氮凍存。

1.3 影響因素

超低溫保存材料能否成功是由材料特性、預培養方法、冷凍保護劑、冷凍方法等因素共同決定的[9]。

1.3.1 材料特性 ? ?因植物種類不同其基因型不同，同一植物的不同部位或者相同植物相同部位的不同大小其生理活性也不同，導致冷凍成效差別較大，因此植物材料的選擇非常重要[21]。例如超低溫保存蘋果莖尖時，6周齡時成活率只有27% ，而29周齡時成活活率達到86%[22-23];張玉芹等[24]研究發現，體積較小的百合組培球莖尖凍存成活率比較高但之后的恢復培育比較難，而體積較大的百合組培球莖尖成活率較低但之后的恢復培育較為容易。

1.3.2 預培養方法 ? ?主要目的是減小細胞內自由水含量，有低溫鍛煉和干燥處理兩種方法[9]。低溫鍛煉可提高細胞液的滲透勢和植株內的α-亞氨基酸和聚胺的濃度，增強材料細胞的抗寒性，故預培養可在相當程度上增加植物材料的成活率[25]。陳加利等[26]通過對不同低溫鍛煉時間對扁桃莖尖存活率的影響進行研究，結果表明，以4周這個時間點為界限，隨著低溫（4 ℃）鍛煉時間的延長，扁桃莖尖經過超低溫保存后的成活率呈現先增加后下降的變化趨勢，而扁桃莖尖沒有經過低溫鍛煉就進行超低溫保存，其成活率為0。干燥處理是使植物細胞的含水量居于一個合適保存水平，防止植物材料細胞內的水分在冷凍過程中生成冰晶對植物造成破壞[27]。

1.3.3 冷凍保護劑 ? ?可以在一定程度上減少超低溫對植物材料造成的傷害，冷凍保護劑可以分為滲透保護劑和非滲透保護劑[28]。滲透保護劑有甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油、二甲基亞砜等化學試劑，分屬小分子物質，容易穿過細胞膜和細胞液中的水分子融合，可阻止凍存材料在冷凍和化凍時因過度脫水而死亡[29]。其中二甲基亞砜自身就為毒性物質，用保護劑處理材料時會對其在一定程度上造成傷害，所以在超低溫保存時應合理選擇冷凍保護劑的種類和用量，及其處理的時間和溫度，否則冷凍保護劑就起不到應有的保護作用[30]。非滲透保護劑有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇等，分屬大分子物質，不能穿過細胞，但在超低溫保存之前，能優先融合溶液中的水分子[29]。

1.3.4 冷凍方法 ? ?不同的冷凍方法具有不一樣的降溫速度，而降溫速度的快慢又會影響超低溫保存后植物材料的成活率，所以不同植物材料的最優降溫速度又不一樣，器官水平上的植物材料則由植物實現低溫鍛煉的強度決定冷凍方法，細胞水平上的植物材料主要由細胞膜的通透性能決定冷凍方法[25]。

1.3.5 解凍方法 ? ?超低溫保存有冷凍和解凍這兩個急速變溫的過程，不僅要選擇適宜的降溫冷凍方法，還要選擇合適的升溫解凍方法，阻止植物材料在升溫過程中細胞內溶液發生二次結冰現象，以及細胞在升溫回暖過程中吸水的滲透作用對細胞膜造成破壞[31]。目前，應用較多的解凍方法有常溫自然解凍、常溫水浸泡解凍和水浴加熱解凍3種，應根據不同的凍存材料，選擇不同的合適的解凍方法[32]。

1.4 保存時限

理論上超低溫保存技術可以“無限期”地保存植物種質資源。1903年瑞典物理化學家Arrhenius研究了溫度對化學反應速度的影響，發現低溫能有效降低生物生化反應速度，并得出了Arrhenius關系式：K=A×exp（-Ea/RT），式中，K為反應速率，R為氣體常數，T為絕對溫度，Ea為活化能，A為Arrhenius因子（常數），計算出生物材料在液氮（-196 ℃）下可保存上百年[33]。

Ozkavukcu等[34]報道了經超低溫保存50年的牛精子解凍后的生理活性及其功能沒有發生太大變化;Caswell等[35]報道了經過超低溫保存28年的豌豆和草莓莖尖恢復再生成功;Walters等[36]報道了蘋果休眠芽經超低溫保存20年嫁接后仍能成活。但是目前對于超低溫保存技術研究時間尚短，所以其所能保存的極限時間需要更長的研究時間來驗證。

2 超低溫保存技術在草莓植物中的應用

2.1 草莓種質資源現狀

2.1.1 野生品種資源 ? ?野生草莓在抗逆性、抗病性、獨有香氣和賞識性等很多方面擁有獨特的優點，可以用作抗性育種的親本[37]。1962—2009年，德國學者Staudt[38]考查了亞洲、歐洲和美洲的野生草莓品種資源，并對從世界各地采集的草莓屬植物樣本進行了比較研究，歸納解決了草莓屬植物品種分類中存在的同種異名問題，完善了草莓品種的劃分體系，認為全球大概有24種草莓屬植物，絕大多數草莓種均為野生或半野生狀態[39]。Hummer等[40]在德國學者Staudt的分類基礎上增加了一個五倍體草莓種，即布氏草莓（Fragaria×bringhurstii Staudt），并且首次發現了天然的十倍體草莓種。

我國是世界野生草莓的發源地之一，亦是野生草莓資源種類最富饒的國家之一，擁有約14個野生草莓品種，主要分布在西南、西北和東北地區，這些地區都是野生草莓種質資源純天然的基因庫，生長著種類繁多的野生草莓品種，保存著很多的種、變種和類型，是寶貴的草莓種質資源[39，41]。1981年起，我國著手建造國家果樹草莓種質資源圃，對我國分散的野生草莓資源進行了考察收集與保存，其中以沈陽農業大學相關工作最為突出，是世界上收集保存野生草莓品種最多的單位之一，至2010年累計收集保存國內外野生草莓種質資源285份，為我國野生草莓種質資源保存和分類使用研究奠定了根基[42-43]。據統計，目前全國共收集保存的野生草莓、本地栽植品種、國外引進栽植品種、培育的新品種等草莓種質資源大概有1 000余種[44]。

2.1.2 栽培品種資源 ? ?世界上最早栽植草莓的國家是法國，其早在14世紀時就有栽植草莓的歷史記錄，當時栽植的是原生于歐洲的野生種草莓，果輕且品質不好[39]。1750年，歐洲培育出弗州草莓與智利草莓的天然雜交種草莓即鳳梨草莓（Fragaria×ananassa Duch. ex Lamarck），由于其果形氣味均與鳳梨相似而聞名，鳳梨草莓是近代現有草莓栽培品種的祖先[45]。全世界現有的草莓栽培種類多達2 000多種，并且仍在不斷培育出新品種[39]。

我國利用野生草莓資源進行種間雜交育種事業起步較遲，栽植品種資源主要有國內自行培育的品種以及從國外引進的歐美品種和日本品種[46-47]。我國的草莓育種大體可分為3個階段：第1階段為20世紀50年代，由江蘇省農業科學院和沈陽農業大學領頭實施的實生選種階段，培養出的品種有‘紫金、‘五月香等;第2階段為80年代末期到90年代末期，由原本的2家育種機關發展到8家育種機關，而且育種方法也逐漸從實生選種改變為雜交育種;第3階段為21世紀至今，草莓育種進入到了極速進展階段，目前已經育成了約有 119 個草莓品種[48]。

2.2 超低溫保存技術在草莓種質資源保存上的應用

Caswell等[35]從草莓試管苗培養物分離出分生組織，用低溫保護劑處理，緩慢冷凍至-40 ℃后并于1979年儲存在液氮中，2007年解凍91個樣本進行體外培養，其成活率（59%）與原始研究報告中1979年冷凍保存8周后的成活率（56%）差別不大，這是目前所有關于草莓超低溫保存研究中唯一保存時間最長且成活率高于50%的報道。

Yamamoto等[49]對15個草莓品種進行了鋁冷凍板玻璃化法超低溫保存研究，結果表明，將草莓匍匐莖在5 ℃先進行3周冷馴化，切取1.5～2.0 mm莖尖于2 mol·L-1甘油和0.3 mol·L-1蔗糖培養基上在5 ℃培養2 d，然后用海藻酸鈉凝膠包埋，25 ℃在加載液中浸泡30 min，之后再PVS2中浸泡50 min，保存于液氮中，解凍后將附在冷凍板上的莖尖直接浸入2 mL1 mol·L-1蔗糖溶液中進行再生，得出15個草莓品種莖尖超低溫保存后平均再生率達到了81%。

Hofer[50]對107個栽培種草莓和20個野生種草莓品種（50份）的基因型譜進行了綜合測定并對其玻璃化法超低溫保存技術進行了研究。結果表明，將草莓匍匐莖進行14 d低溫馴化（-1 ℃，16 h黑暗;22 ℃，8 h光照），然后切取莖尖（1～2 mm）進行DMSO預培養、冰上PVS2玻璃化、液氮保存、恢復培養，得出栽培種草莓和野生草莓平均再生率分別為89.55%和85.50%，該技術被應用為德國國家草莓基因庫183個草莓品種和德累斯頓-皮爾尼茨新野生草莓基因庫收集的270個草莓品種的超低溫保存標準化技術。

2.3 超低溫保存技術在草莓脫毒苗培育上的應用

羅婭等[51]利用超低溫保存技術對‘紅顏草莓進行脫毒苗的培育，結果表明，在含0.3 mol·L-1預培養基上暗培養7 d，室溫下LS（加載液）裝載60 min，0 ℃下PVS2脫水1 h，液氮處理1 h，40 ℃水浴化凍120 s，用含1.2 mol·L-1蔗糖的液體MS培養基洗滌2次，獲得脫毒苗的再生率為69.03%，利用RT-PCR病毒檢測體體系檢測出脫毒苗中不含草莓4種主要病毒（草莓皺縮病毒、草莓斑駁病毒、草莓鑲脈病毒和草莓輕型黃邊病毒），即獲得的‘紅顏草莓脫毒苗脫毒率達到了100%。

陳曦等[52]以‘福莓1號草莓莖尖為材料，對玻璃化法超低溫保存技術進行了研究，結果表明，外植體低溫鍛煉2 周、莖尖暗培養3 d，1/2濃度PVS2溶液及全濃度PVS2溶液0 ℃進行2次處理，液氮冷凍保存1 h以上，40 ℃的水浴中快速解凍2 min，卸載后莖尖先暗培養3 d后轉入正常光照培養，再生培養成活率約30%，4種主要病毒的脫除率為100%。

2.4 超低溫保存后草莓再生苗遺傳穩定性分析

朱文濤[53]以野生種‘五葉草莓和攜帶草莓輕型黃斑病毒的‘全明星草莓為材料，研究了超低溫保存的最佳條件、超低溫脫除草莓輕型黃斑病毒的效率、超低溫保存后草莓基因組DNA序列的穩定性以及基因組DNA甲基化的變化水平。結果表明，草莓組織培養材料在4 ℃條件下低溫煉苗3周，切取2～3 mm的離體莖尖，4 ℃下在固體預處理培養基中培養3 d，25 ℃下液體預培養液浸泡30 min，20 ℃下PVS2處理1 h時，‘五葉草莓和‘全明星草莓成活率分別達到79.7%和64.3%，采用擴增片段長度多態性（AFLP）技術分析了超低溫前后的‘五葉草莓和‘全明星草莓的基因組DNA序列，沒有發現多態性差異條帶，即經過超低溫之后的草莓植株基因組DNA序列穩定，但是‘五葉草莓和‘全明星草莓基因組DNA甲基化水平分別降低了6.73%和3.83%。

3 超低溫保存中存在的問題及前景展望

超低溫保存技術是目前種質資源長期保存的理想方法，已成功應用于上百種植物，隨著超低溫保存技術的發展，可保存材料范圍不斷擴大，材料保存時間也不斷延長。但是，目前對超低溫保存的研究多側重于驗證某種植物的超低溫可貯性，以及保存技術的研究，對凍存機理以及材料凍存前后生理狀態的研究尚不深入。此外，該技術尚未形成普遍適用于各種材料的超低溫保存技術體系，也就是說一種材料一種方法，換種材料就需要重新探索一種新的處理方法。雖然物種進行規模化超低溫保存的數量仍較少，但是植物種質資源的超低溫保存技術具有廣闊的發展前景，尤其在材料脫毒、抗性育種和遺傳轉化方面將具有更大的應用價值。

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