植原體對冬棗根部可培養內生細菌菌群的影響

陳有忠 邱志偉 于奧安 朱偉垚 楊俊林 陳招榮

摘 ? ?要：棗瘋病是棗樹上由植原體引起的一種毀滅性病害，但有關棗瘋病植原體與寄主根部內生細菌間的相關性鮮有研究。本試驗采用常規分離培養方法從春季冬棗根部分離純化內生細菌，通過PCR擴增出內生細菌16S rRNA基因的DNA片段，測序后利用NCBI中的BLAST軟件進行序列同源性比對，對健康和感病冬棗樹根部可培養內生細菌進行統計，根據二者對比結果初步判斷植原體對冬棗根部可培養內生細菌菌群的影響。結果表明，健康冬棗樹分離出18個菌株，鑒定出6個屬（除2個僅鑒定到科水平外）的內生細菌，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）6株、假單胞菌屬（Pseudomonas）5株、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）2株、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）1株、志賀氏菌屬（Shigella）1株、埃希氏菌屬（Escherichia）1株;感病冬棗樹分離出17個菌株，鑒定出2個屬的內生細菌，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）10株和假單胞菌屬（Pseudomonas）7株;感病冬棗樹根部可培養內生細菌菌群屬水平較健康冬棗樹減少4個屬，說明棗瘋病導致冬棗根部內生細菌菌群在屬水平上的降低。

關鍵詞：棗瘋病;內生細菌;16S rRNA基因

中圖分類號：S665.1;S436.6 ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.003

Abstract： Jujube Witches Broom（JWB） is a devastating disease caused by phytoplasma in jujube trees. There are few studies on the correlation between the phytoplasma and endophytic bacteria in the host root. In this study， endogenous bacteria were isolated and purified from Chinese winter jujube roots by conventional culture method in spring， the DNA fragments of endogenous bacteria 16S rRNA gene were amplified by PCR， and then the BLAST software in NCBI was used to search the sequencing results for sequence homology alignment. The effects of phytoplasma on the endophytic bacteria of Chinese winter jujube were analyzed through the comparison between the roots of healthy and infected. The results showed that 18 strains were isolated from the healthy Chinese winter jujube， which were identified to six genera except for 2 strains identified to the family level， including Bacillus（6 strains）， Pseudomonas（5 strains）， Stenotrophomonas（2 strains）， Chryseobacterium（1 strain）， Shigella（1 strain）， and Escherichia（1 strain）. 17 strains were isolated from the JWB infected Chinese winter jujube， which were identified to two genera， including Bacillus（10 strains） and Pseudomonas（7 strains）.The endophytic bacteria in root of infected Chinese winter jujube were 4 genera less than that of the healthy Chinese winter jujube， indicating that the endophytic bacteria in the root of infected Chinese winter jujube was decreased by the disease of JWB.

Key words： Jujube Witches Broom; endophytic bacteria; 16S rRNA gene

棗（Ziziphus jujube Mill）是鼠李科棗屬植物，屬于溫帶落葉小喬木，生長于海拔1 700 m以下的山區、丘陵或平原，適應性強、種植范圍廣，是我國特色優勢果樹和第一大干果樹種，在我國農業經濟中具有重要地位。據記載，我國棗樹的種植栽培已有3千～4千年的歷史，棗樹資源豐富，品種優良[1]。棗瘋病是一種由植原體引起的高致死傳染性病害，幾乎分布于國內外所有棗樹分布區，且絕大多數早熟品種對其敏感，棗樹一旦染病，通常幼樹1～2年、成齡樹3～5年即逐漸枯死，早在1951年，我國很多地區就發現有棗瘋病危害，現仍是棗業發展的一大障礙[2]。植原體最早是在桑樹萎縮病等病株的篩管切片中發現，經相關學者系統地比較研究，確定了棗瘋病是由植原體感染引起，而不是病毒或病毒與植原體復合侵染所造成的結果，而關于植原體引起黃化的作用機制主要是其在篩管細胞中大量增殖引起阻塞所致[3-4]。劉棟等[5]通過對發病葉片組織結構比較分析，結果揭示了棗瘋病發病后葉片的細胞結構發生變化，如細胞數量減少、排列紊亂，甚至某些特殊結構缺失等。

棗瘋病防治相關研究主要集中在抗棗瘋病新品種品系的選育、藥物治療等方法，但新品種需要較長時間，而且抗病性易被克服，藥物治療持續時間短，易復發[6-7]。植物內生菌（Endophyte）是植物組織內的正常菌群，也是植物微生態系統中的天然組成成分，不僅包括互惠共利和中性的內共生微生物，而且包括潛伏在宿主體內的病原微生物[8]。作為一種新的生物資源，植物內生菌可通過多種途徑抑制病原菌生長，達到防治病害的目的，例如產生抗生素類、水解酶類、植物生長調節劑和生物堿類物質，與病原菌競爭營養物質，增強宿主植物的抵抗力以及誘導植物產生系統抗性等，故可用于防治植物病害，尤其是化學防治較為困難的植物病害[9-10]。但目前尚未有關于棗瘋病植原體與寄主根部內生細菌間相關性研究，鮮有針對于棗瘋病植原體生物防治方面的研究。

本課題組前期研究發現春季棗瘋病植原體主要從根部組織通過維管束組織進入植株上部幼嫩組織如幼芽和葉片中[5]。根部是植原體主要過冬場所，因此，本研究采集健康及染棗瘋病的冬棗樹根部組織，對內生細菌進行分離、純化、培養及形態和分子鑒定，研究健康及染棗瘋病的冬棗樹根部內生菌種類多樣性，為冬棗病害防治提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自天津農學院東校區棗園，在同地塊中選取健康冬棗樹和感染棗瘋病冬棗樹，每3株植株根部組織合并為1個樣品，分別將健康冬棗樹（Z）和感染棗瘋病冬棗樹（B）的根部清洗干凈，置于4 ℃冰箱內保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 內生細菌的分離純化 ? ?先將健康和感染棗瘋病的冬棗樹根部組織用自來水清洗，去除表面的泥土，用濾紙吸干或晾干殘留的水分后，用天平分別稱取0.2 g根部組織。在超凈工作臺下，將根部完全浸泡在75%的乙醇溶液10 min，再用無菌水洗3～4次，將最后1次清洗的水涂布在LB平板上用來檢查滅菌的效果。將表面消毒干凈的根部組織用滅過菌的剪刀剪碎置于無菌研缽中，加入1 mL無菌水充分研磨。將研磨液轉移至無菌試管中，1 000 r·min-1離心1 min去除大部分根部組織，取上清液進行梯度稀釋10-1～10-3，每個梯度取100 μL涂布在LB固體培養基上培養，每個處理重復3次，置于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養，每天定時觀察菌落的生長狀況。

待內生菌長出后，根據菌落的形態特征分別挑取不同類形的內生細菌，在LB固體培養基中用平板劃線法反復純化，直到在平板表面長出單菌落后，4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 革蘭氏染色 ? ?為更好地觀察內生細菌的菌體形態，對內生細菌進行革蘭氏染色[11]，通過鏡檢對分離出的內生細菌進行初步分類鑒定。

1.2.3 內生細菌DNA的提取 ? ?在超凈工作臺下，在酒精燈5 cm附近將液體LB培養基倒入無菌試管中，用無菌接種針挑取內生細菌的單菌落放于試管中，放置于33 ℃的搖床（200 r·min-1）搖培10 h。用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒提取DNA。將最后洗脫的DNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.4 PCR擴增16S ?rRNA的DNA片段 ? ?以冬棗樹根部組織分離出內生細菌的DNA為模板進行PCR擴增。

引物序列為：27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）

1 492R（5-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3）

PCR反應擴增體系見表1。

PCR擴增程序見圖1。

PCR反應結束后，取3 μL PCR產物與1 μL 6×DNA Loading Buffer混合后加入1.0%瓊脂糖凝膠點樣電泳。待DNA跑至凝膠中央時結束電泳，Goldview染色劑染色10 min，使用凝膠成像系統觀測電泳條帶并攝影記錄。

將PCR獲得的產物送至華大基因公司測序，將所得的各個菌株的基因序列測序結果在NCBI （https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）數據庫中進行BLAST比對，篩選出與其同源性最高的已知序列，根據Clarridge[12]提出的16S rRNA基因序列同源性高于99%可確定種，同源性在95%～99%之間可確定屬的原則，初步確定所測菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離結果

觀察健康和染病冬棗樹分離出的內生細菌（圖2）可以發現，在涂布了健康和染病冬棗樹菌液的培養皿上，均長出了大量細菌菌落，說明冬棗樹的根部組織存在著豐富的內生細菌;從健康冬棗樹和染病冬棗樹根部組織分離出來的內生細菌菌落形態看，健康冬棗樹比染病冬棗樹分離出來的內生細菌的豐富度要大;分離得到的內生細菌根據形態差異進行平板劃線純化，各內生菌菌株生長速度和菌落形態存在差異，經過形態學鑒定和再分離純化，最終獲得正常冬棗樹內生細菌18個菌株（Z1～Z18號），染病冬棗樹內生細菌17個菌株（B1～B17號）。

2.2 革蘭氏染色結果

將分離得到的內生細菌進行了革蘭氏染色，對內生細菌進行初步分類鑒定，其中紫色為陽性菌，紅色為陰性菌。由革蘭氏染色結果（表2）可知，革蘭氏陽性菌共有16個菌株，革蘭氏陰性菌共有19個菌株;健康植株根部內生細菌菌株中12株為革蘭氏陰性菌，6株為革蘭氏陽性菌，而發病植株根部內生細菌菌株中7株為革蘭氏陰性菌，10株為革蘭氏陽性菌。

2.3 細菌16S rRNA基因擴增結果

將分離出來的內生細菌的DNA作為模板，引物以27 F/1 492 R進行PCR擴增，經1.0%的瓊脂糖凝膠上點樣電泳。結果（圖3、圖4）顯示，健康冬棗樹和染病冬棗樹都跑出了約為1 500 bp左右的目的條帶，說明PCR擴增出了內生細菌的16S rRNA基因的DNA片段。

2.4 內生菌檢測結果

經測序得到35個菌株16S rRNA基因的DNA片段序列，經過序列同源性比對，結果（表3和表4）。

由表3可以看出，健康冬棗樹根部組織內生菌分屬于6個屬，菌株Z1為金黃桿菌屬（Chryseobacterium，革蘭氏陰性菌），序列相似度為98%;菌株Z2的16S rRNA基因片段序列與比對序列相似度為99%，可以確定其為埃希氏菌屬（Escherichia，革蘭氏陰性菌）成員;菌株Z4、Z14、Z15、Z16、Z17和Z18的16S rRNA基因片段序列與比對序列相似度在97%～99%之間，可以確定這些菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus，革蘭氏陽性菌）;菌株Z6的16S rRNA基因片段序列與比對序列相似度為99%，可以確定該菌株為志賀氏菌屬（Shigella，革蘭氏陰性菌）成員;菌株Z7、Z8、Z9、Z10、Z11的16S rRNA基因片段序列與比對序列相似度在97%～99%之間，可以確定這些菌株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas，革蘭氏陰性菌）;菌株Z12和Z13的16S rRNA基因片段序列與比對序列相似度為99%，可以確定其均為寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas，革蘭氏陰性菌）成員;此外，菌株Z3和Z5的16S rRNA基因片段序列與比對序列相似度均小于95%，初步確定其為腸桿菌科（Enterobacteriaceae，革蘭氏陰性菌）成員，無法準確確定其屬水平的分類地位。

由表4可以看出，感病冬棗樹根部組織內生菌分屬于假單胞菌屬和芽孢桿菌屬，相似度均≥99%，較健康冬棗樹根部組織內生細菌減少4個屬的物種。

3 結論與討論

植物內生菌因植物種類不同存在差異，藍江林等[13]從不同來源地的茄子植株中分離到芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter）、微桿菌屬 （Microbacterium）、耶爾森菌屬（Yersinia）等18屬的細菌;Cui等[14]對不同來源、不同棗品種以及不同部位的內生細菌進行的分離純化，分析其分類地位，得到了芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、節桿菌屬（Arthrobacterium）、濕斯捷連科屬（Nesterenkonia）、寡養單胞菌屬、土地桿菌（Pedobacter）等共13個屬，16個種內生細菌，并發現根部內生細菌菌群數量和種類豐度都高于其他組織中的內生細菌，而且樣品品種和采集地區因素也對棗內生細菌菌群有明顯的影響;秦曉婧等[15]從冬棗果肉組織中分離得到了4株芽孢桿菌內生細菌菌株。

本試驗從感染棗瘋病植株和健康植株的冬棗根部組織分別分離得到17和18株內生細菌，其中健康冬棗樹根部組織內生菌分屬于6個屬，即芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、志賀氏菌屬、寡養單胞菌屬、金黃桿菌屬、埃希氏菌屬，而感病冬棗樹根部組織內生菌分屬于芽孢桿菌屬和假單胞菌屬2個屬，較健康冬棗樹根部組織內生細菌減少4個屬的物種，說明感病植株使冬棗樹根部內生細菌屬水平的種類減少，應該與植原體在棗樹根部大量繁殖有關。Eichmeier等[16]通過高通量測序技術明確了植原體侵染對核果類植物的韌皮部內生細菌菌群在種類豐度和數量方面都產生一定的影響。

本研究中分離得到的內生細菌在屬水平上較Cui等[14]少，這應該與樣品品種以及棗樹生長環境不同有關。但芽孢桿菌屬、假單胞菌屬在所分離的內生細菌中占比均較高，芽孢桿菌易于在田間定殖，能夠產生脂胎類、聚酮類以及抗菌蛋白等抑菌物質，因此芽孢桿菌屬成員被廣泛地應用于生產中病害生物防治[17]。蔡麗等[18]從鳳凰單叢茶分離篩選出具有抑菌活性的甲基營養型芽孢桿菌，對梨果多種病原菌物具有較強的抑制作用;張曉麗等[19]在番茄植株內部分離得到一株對番茄灰霉病病原菌具有較高拮抗效果且耐高溫高鹽、耐儲藏的內生細菌JZ3，而這株內生菌經鑒定為解淀粉芽孢桿菌;Lang[20]等從冬棗中分離得到3株對棗縮果病有一定抑制作用的內生枯草芽孢桿菌。本試驗也分離出了芽孢桿菌屬，那么芽孢桿菌屬的物種是否有可能影響植原體的生長，從而影響植物體內內生菌的多樣性，能否作為棗瘋病的生防菌還需要進一步驗證。

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