‘海爾特茲’樹莓組織培養及其葉柄再生體系的建立

劉麗 高登濤 魏志峰 郭俊英 李秋利 劉軍偉 朱會調

摘 ? ?要：為研究樹莓的工廠化育苗技術，提高樹莓育苗質量和效率，以樹莓品種‘海爾特茲帶腋芽的莖段為試驗材料，通過對其腋芽初代培養、莖段增殖、葉柄不定芽和根的誘導等過程中植物生長物質合理組合，及防止莖段褐化的最適pH值進行篩選，建立‘海爾特茲樹莓組織培養及其葉柄再生體系。結果表明，腋芽誘導的最佳培養基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA，萌芽率100%;莖段最佳增殖培養基為MS+0.5 ?mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，pH值為5.70，增殖系數為5.0;誘導葉柄產生愈傷組織再生不定芽的最佳培養基為MS+2.0 mg·L-1 TDZ +1.0 mg·L-1 IBA，其愈傷組織誘導率為100%，不定芽再生率為53%;幼苗最佳生根培養基為 1/2 MS+0.7 mg·L-1 IBA，生根率達95%。

關鍵詞：樹莓;‘海爾特茲;葉柄;愈傷組織

中圖分類號：Q813.1+2;S663.2 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.005

Abstract：In order to improve the quality and efficiency of industrial seedling cultivation of raspberry， stem segments with axillary buds of the raspberry cultivar 'Heritage' were used as experiment material， the regeneration system of leaf petioles was established through ?screening of the reasonable plant growth substances combination in the process of axillary bud primary culture， stem segment proliferation， petiole adventitious bud and root induction， and the optimum pH value to prevent stem segment browning. The results showed that the optimum medium for axillary bud induction was MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA， and the germination rate was 100%; the optimum medium for stem segment proliferation was MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA， and the pH value was 5.70， which the multiplication coefficient was 5.0; the optimum medium for petiole callus regeneration was MS+2.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IBA， which the induction rate of callus was 100%， and the regeneration rate of adventitious bud was 53%; the optimum medium for rooting was 1/2 MS+0.7 mg·L-1 IBA， and the rooting rate was 95%.

Key words： raspberry; 'Heritage'; petiole; callus

樹莓（Rubus idaeus）是薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）多年生落葉灌木型果樹，其果實營養豐富，除含有豐富的有機酸、氨基酸和維生素外，還含有鞣化酸、黃酮類物質和SOD等，具有很好的保健功能，被稱為“第三代水果”[1-5]。近幾年，我國樹莓發展呈逐年增長趨勢，其生產量由2012年的1萬t發展到2015年的2.5萬t[6]。

‘海爾特茲是引自美國紐約州的雙季樹莓品種，果實口味獨特，品質優良，色澤鮮艷，營養豐富，硬度大，抗病蟲能力強，栽培容易，管理簡單，經濟效益顯著[7-8]，是目前市場上推廣相對較多的一個品種。

目前，我國樹莓種苗繁殖生產上多采用根蘗、扦插、壓條等技術，不僅苗木繁殖系數低、易受季節影響，同時易積累病毒，導致品質變劣、產量下降，造成生產上重大的經濟損失[9-10]。國外的樹莓生產上多采用組培苗甚至脫毒苗建園，組培苗根系發達、生長健壯，連續產量高，無病蟲害等優點，有利于樹莓產業的健康發展。

本試驗對‘海爾特茲樹莓組培及其葉柄再生體系建立的條件進行探討和優化，為建立工廠化育苗體系及進一步的倍性育種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試樹莓品種為‘海爾特茲，2015年栽種于中國農業科學院小漿果種質資源圃，于2018年春季剪取其新萌發枝條裝入冰盒帶回實驗室。

1.2 方 法

試驗所用MS培養基均由30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂組成。

1.2.1 消毒滅菌 ? ?截取‘海爾特茲樹莓新發枝條上端15 cm，剪去葉片，用洗潔精洗凈，在流水下沖洗2～3 h;在超凈工作臺上，將莖段在75%酒精中消毒30 s，再置于0.1%升汞中消毒5 min，無菌水沖洗4～5次，放在濾紙上，將材料剪成1 cm左右帶芽莖段（芽下部莖稍長些）供接種使用。

1.2.2 初代培養 ? ?將接種莖段分別接種于含不同植物生長物質的MS培養基中，pH值為5.80。植物生長調節物質設4個處理：1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 IAA;每個處理10瓶，每瓶接種3個外植體。接種30 d后調查腋芽萌芽情況，統計萌發率。

1.2.3 防褐化處理 ? ?將經過初代培養產生的莖段分別接種于不同pH值的MS培養基中，設3個處理，pH值分別為5.80，5.75，5.70。每個處理10瓶，每瓶接種3個外植體。接種15 d后調查褐化情況，統計褐化率。1.2.4 莖段增殖 ? ?經初代培養產生的莖段，需進行增殖培養。將萌發后的幼嫩無菌苗剪取成1～2 cm轉移到添加不同植物生長物質的MS培養基中，pH值為5.70，植物生長調節物質設8個處理：1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.1g·L-1 IBA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 IBA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 IBA。每個處理10瓶，每瓶3株無菌苗，培養30 d后觀察不定芽分化和生長情況，計算增殖系數。

1.2.5 葉柄不定芽誘導 ? ?經過初代培養萌發的腋芽長至3 cm左右，在無菌工作臺上取下葉柄，葉柄剪至0.5 cm長，分別接種于6種添加不同植物生長物質的MS培養基中，pH值為5.80。植物生長物質設6個處理：2.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IAA;2.0 mg·L-1 TDZ+0.5 mg·L-1 IAA;2.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IBA;2.0 mg·L-1 TDZ+0.5mg·L-1 IBA;1.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IAA;1.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IBA。每個處理6瓶，每瓶放置5個剪好的葉柄。培養40 d后觀察愈傷形成和出芽生長情況。

1.2.6 根的誘導 ? ?以1/2 MS培養基為基本培養基，pH值為5.80。將誘導產生的>2 cm的不定芽接種于培養基中，培養基共設計3種不同濃度的IBA組合，分別為1.0，0.7，0.5 mg·L-1。每個處理10瓶，每瓶接種3株不定芽，培養30 d后觀察并記錄生根情況。

1.3 數據統計與分析

采用Microsoft Excel2007對數據進行計算分析。

2 結果與分析

2.1 不同植物生長物質組合對‘海爾特茲腋芽出芽的影響

‘海爾特茲樹莓莖段初代培養效果詳見圖1和表1。由表1可知，當初代培養MS中6-BA為1.0 mg·L-1時，‘海爾特茲樹莓莖段萌芽率隨著NAA和IAA濃度的增加而增加，以1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA濃度的植物生長物質組合效果最佳，萌芽率可達到100%。

2.2 不同pH值對莖段褐化率的影響

由表2可知，經過初代培養萌芽的腋芽接種在不同pH值MS培養基中均出現不同程度褐化，其褐化率隨著pH值的降低而降低，在pH值為5.70的MS培養基中褐化率最低，為16.7%。

2.3 不同植物生長物質組合對‘海爾特茲莖段增殖的影響

由表3可知，在8個不同生長物質組合中，‘海爾特茲莖段的增殖培養效果以0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA組合處理最好，其增殖系數為5.0。

2.4 不同植物生長物質組合對‘海爾特茲葉柄愈傷組織誘導和不定芽形成的影響

葉柄在愈傷組織誘導培養基中兩端逐漸膨大（圖2），不同植物生長物質組合處理均可產生愈傷（圖3），即各處理愈傷組織誘導率均為100%（表4），但有些處理葉柄膨大成愈傷組織后逐漸變褐不能產生再生芽，故各處理不定芽（圖4）再生率不同，6個含有不同濃度的植物生長物質組合處理中，以2.0 mg·L-1TDZ +1.0 mg·L-1IBA處理愈傷組織不定芽再生率最高，為53%（表4）。

2.5 不同濃度的植物生長物質對‘海爾特茲幼苗生根的影響

將生長至2～3 cm的健壯幼苗剪下接種到生根培養基中，生根效果良好（圖5）。由表5可知，隨著培養基中IBA濃度的增加，‘海爾特茲幼苗生根率呈先升后降的趨勢，在IBA為0.7 mg·L-1時生根率最高，達到95%。

3 結論與討論

褐化、菌類污染和玻璃化現象一直是組織培養中的難題[9]。褐化是由于酚類物質被多酚氧化酶（PPO）氧化成醌類物質，抑制了相關酶的活性，從而阻礙培養材料的正常生長，甚至導致培養物死亡[10]。配制培養基時，適當地降低pH值可以降低多酚氧化酶活性和底物利用率，進而抑制褐變，升高pH值則明顯加重褐變[11]。金堅敏[12]在水稻的體細胞培養過程中發現，pH值為 4.5～5.0 的MS培養基可使愈傷組織保持良好的生長狀態，而pH值為5.5～6.0時，愈傷組織發生嚴重褐化。在本試驗中，‘海爾特茲的增殖培養過程中褐化率隨著培養基pH值的降低而降低，當pH值為5.70時，其褐化率為16.7%，褐化問題得到有效緩解，而有關pH值繼續降低是否有助于其褐化率進一步降低的問題尚需討論，但在本試驗中因培養基pH值低于5.70時不易凝固，故pH值最低定為5.70。

李艷霞[13]以樹莓品種‘波魯德莖尖為材料，莖尖誘導最佳培養基為MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA+0.5 mg·L-1 GA3，建立了離體培養再生體系。潘菊等[14]以帶腋芽莖段為外植體，研究了樹莓的組織培養與快速繁殖技術，得出樹莓的最佳誘導培養基為MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA;最佳增殖培養基為MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA;最佳生根培養基為1/2MS+0.05 mg·L-1NAA+20 g·L-1白糖。本試驗側重于對葉柄進行再生培養，建立了‘海爾特茲完善的組培再生體系，為工廠化育苗和在組培再生基礎上的倍性育種奠定了基礎，其腋芽誘導最佳培養基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA +1.0 mg·L-1 IAA，萌芽率100%;莖段最佳增殖培養基為MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，增殖系數為5.0;誘導葉柄產生愈傷組織再生不定芽的最佳培養基為MS+2.0 mg·L-1 TDZ +1.0 mg·L-1 IBA ，其愈傷組織誘導率為100%，不定芽再生率為53%;幼苗最佳生根培養基為1/2 MS+0.7 mg·L-1 IBA，生根率達95%。

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