山藥根際土壤微生物16S rRNA多樣性及影響因素*

張紅霞 張舒雅 張玉濤 張?zhí)炀?/p>

（1 安順學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州安順 561000）

（2 安順學(xué)院/貴州省科技廳土壤污染控制與修復(fù)工程技術(shù)中心，貴州安順 561000）

（3 武漢貝納科技服務(wù)有限公司，湖北武漢 430070）

山藥（Dioscorea opposita）為薯蕷科多年生草質(zhì)藤本植物，其地下根莖為主要利用器官，是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物。現(xiàn)代藥理研究表明，山藥具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖等作用，其主要化學(xué)成分有多糖、尿囊素、皂甙等［1］。我國栽培山藥歷史悠久，由于栽培的地域環(huán)境條件不同和人工選擇的原因，形成了各具特色的地方品種。貴州安順山藥因口感軟糯，富含蛋白質(zhì)、多糖等成為大眾喜愛的品種之一。土壤生態(tài)環(huán)境因子、養(yǎng)分狀況是影響植物生長及品質(zhì)形成的主要因素，隨著人們對土壤微生物生態(tài)因子重要性認(rèn)識(shí)的不斷深入，將土壤微生物學(xué)特性作為評價(jià)土壤質(zhì)量和健康程度的相應(yīng)指標(biāo)已廣受關(guān)注，其結(jié)果可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐［2］。陸地生態(tài)系統(tǒng)中的土壤微生物群落多樣性受到土壤養(yǎng)分的顯著影響［3］。研究表明，山藥連作會(huì)破壞土壤耕層微生物種群結(jié)構(gòu)，抑制土壤酶活性，可能導(dǎo)致山藥連作障礙［4］。隨著山藥種植規(guī)模的擴(kuò)大，為保證其優(yōu)良品質(zhì)，推行規(guī)范化種植，開展了大量栽培管理措施、施肥及土傳病害防治方面的研究，然而結(jié)合土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，分析其與土壤化學(xué)性質(zhì)、根莖營養(yǎng)成分關(guān)系方面的研究鮮有報(bào)道。高通量測序技術(shù)具有可全面、準(zhǔn)確獲得微生物群落結(jié)構(gòu)信息的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于微生物研究中［5-7］。本研究采用高通量測序技術(shù)，通過提取不同環(huán)境土壤樣品的DNA，選擇合適的通用引物擴(kuò)增16S的目標(biāo)區(qū)域，檢測目標(biāo)區(qū)域的序列變異和豐度，分析環(huán)境中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，結(jié)合根際土壤養(yǎng)分狀況及部分酶活性的檢測，研究山藥根際土壤中細(xì)菌群落特征與土壤養(yǎng)分、根莖糖類含量的關(guān)系，闡明影響山藥根莖中營養(yǎng)物質(zhì)累積的重要土壤生態(tài)因子，對于研究山藥種植專用生物肥料及其種植土壤環(huán)境評價(jià)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

前期對安順4個(gè)山藥種植區(qū)山藥營養(yǎng)成分的分析發(fā)現(xiàn)，不同種植區(qū)的山藥根莖在灰分、粗纖維和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)上有顯著差異［8］，因此本研究選取安順市轄區(qū)內(nèi)7個(gè)集中種植山藥的村寨（表1）采集樣本，每個(gè)村寨選取連續(xù)種植山藥2年的有代表性的5個(gè)地塊作為樣本（5個(gè)重復(fù)）。于2017年3月10日至30日期間整地并施基肥后，用薯蕷科薯蕷屬植物山藥（經(jīng)安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院沈昱翔副教授鑒定）蘆頭種植。于2017年10月3日至15日期間采集土壤樣品及山藥樣品，每個(gè)地塊按5點(diǎn)取樣法，將山藥根莖采挖出后，抖落根莖上附著的土壤作為根際土壤，混勻后儲(chǔ)存于無菌自封袋中，按表1編號后低溫運(yùn)輸，-20℃冰箱保存。土壤均為黃棕壤。

表1 研究樣本基本情況Table 1 Basic information of the experiment plots of the study

1.2 16S rRNA基因擴(kuò)增、文庫構(gòu)建及測序

采用土壤DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取土壤樣本總DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器設(shè)備有限公司）測定純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA回收試劑盒回收，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以提取的總DNA為模板，采用16SrDNA V3-V4區(qū)引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）：338F：（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′），806R：（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TIANGEN）回收目的條帶，使用Qubit熒光定量系統(tǒng)對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量，等量混合不同樣品PCR 回收產(chǎn)物，構(gòu)建高通量測序文庫，IlluminaHiseq 2500上機(jī)測序。

1.3 根際土壤生態(tài)指標(biāo)及根莖糖類指標(biāo)檢測

土壤化學(xué)性質(zhì)采用常規(guī)分析方法［9］，總有機(jī)碳采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化容量法，堿解氮采用堿解擴(kuò)散法，有效磷采用0.5mol?L-1NaHCO3浸提—鉬藍(lán)比色法，速效鉀采用1mol?L-1NH4OAc浸提—火焰分光光度法，pH用電位法（酸度計(jì)）。

土壤酶活性測定［10］：過氧化氫酶活性測定采用容量法（以KMnO4計(jì)，mL?g-1?30min-1），蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法，脲酶活性測定采用靛酚藍(lán)比色法，磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉（4-氨基安替比林）比色法。

山藥根莖糖類指標(biāo)檢測：可溶性糖、淀粉含量測定［11］采用硫酸蒽酮法和高氯酸法；粗多糖測定［12］采用85%乙醇除去低聚糖、單糖、雙糖等，用95℃水浴水提后硫酸蒽酮顯色，于620 nm波長下比色法測定；粗蛋白含量測定采用GB/T5009.5-2010中的分光光度法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

樣品經(jīng)IlluminaHiseq 2500測序進(jìn)行PE250雙端測序后，對獲得的原始測序序列進(jìn)行過濾和質(zhì)控，通過質(zhì)量分值衡量測序序列的質(zhì)量和拼接效果，選取長度大于100bp，平均質(zhì)量分值＞20，拼接序列重疊區(qū)域錯(cuò)配率小于20%的序列作為有效序列，進(jìn)行下游分析。以97%水平的SILVA數(shù)據(jù)庫為參考，計(jì)算OTUs的豐度。

采用QIIME軟件進(jìn)行α多樣性分析，包括香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)、文庫覆蓋率。采用QIIME分析流程，使用UniFrace方法進(jìn)行β多樣性分析。

采用Vegan軟件進(jìn)行典型相關(guān)分析（Canonical Correlation Analysis,CCA）。使用R軟件做環(huán)境因子與物種豐度的相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 根際土壤生態(tài)特性與根莖營養(yǎng)成分含量

從表2可見，7個(gè)樣本土壤偏酸性，且其養(yǎng)分含量及酶活性均有顯著差異。表3可見，7個(gè)樣本的山藥根莖中4種營養(yǎng)成分含量也呈現(xiàn)一定差異。對根際土壤的化學(xué)性質(zhì)與山藥根莖中營養(yǎng)成分相關(guān)性的分析（表略）可知，堿解氮與有機(jī)質(zhì)呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.877），過氧化氫酶與有效磷呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.811），山藥根莖中粗多糖與根際土壤的有機(jī)質(zhì)呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.770），可溶性糖與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮及堿解氮含量呈極正顯著相關(guān)或顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.942、0.810、0.790），上述結(jié)果說明土壤碳、氮養(yǎng)分能夠促進(jìn)山藥根莖中糖的積累。

表2 山藥根際土壤生態(tài)特性Table 2 Ecological characteristic of the rhizosphere soil of Chinese yam

2.2 物種相對豐度統(tǒng)計(jì)

高通量測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾、質(zhì)控后，對7個(gè)樣本隨機(jī)抽取的有效序列所對應(yīng)的稀釋曲線分析，結(jié)果表明深度測序已接近飽和，可用于后續(xù)分析。在97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。圖1顯示了“門”水平的物種相對豐度。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，相對豐度大于1%的菌群有9個(gè)，分別為變形菌門（31.0%）、綠彎菌門（22.8%）、酸桿菌門（22.7%）、放線菌門（8.6%）、擬桿菌門（4.3%）、厚壁菌門（3.1%）、奇古菌門（1.5%）、芽單胞菌門（1.3%）和硝化螺旋菌門（1.1%）。從數(shù)據(jù)分析結(jié)果可見，變形菌，綠彎菌和酸桿菌、放線菌是優(yōu)勢種群（相對豐度＞5%），它們的相對豐度均大于5%，占了總序列的85.1%；此外還發(fā)現(xiàn)了相對豐度小于1%的其他44個(gè)稀有門類，但分布不均勻，僅在部分樣本中發(fā)現(xiàn)。在“屬”水平上進(jìn)行分析，7個(gè)樣本中均發(fā)現(xiàn)慢生根瘤菌屬（1.4%），5個(gè)樣本（S2, S3, S5, S6,S7）發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬（0.4%）。從結(jié)構(gòu)來看，表現(xiàn)為7個(gè)樣本共有大多數(shù)相同的細(xì)菌群落，但也存在一定差異。已有研究表明土壤pH、有機(jī)碳和全氮是土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主導(dǎo)因子［13］，據(jù)此分析認(rèn)為本研究7個(gè)樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異的原因可能與土壤理化性質(zhì)有關(guān)。

表3 山藥根莖中營養(yǎng)成分含量Table 3 Nutrient contents in rhizome of Chinese yam /(g?100g-1)

2.3 α多樣性指數(shù)與β多樣性聚類

香農(nóng)指數(shù)反映物種豐富度和均度的影響，用于說明微生物群落分布的均勻度，其數(shù)值大小主要衡量非均衡分布狀況。Chao1指數(shù)僅簡單指群落中物種的多樣性，不考慮豐度情況。對表4的兩種多樣性指數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明S5、S6、S7這3個(gè)樣本的細(xì)菌群落物種豐度、多樣性和均度比較接近；S1、S2和S4樣本的在一個(gè)水平；而S3樣本的菌群豐度、多樣性與均度與其余樣本比較處于中間。從細(xì)菌群落多樣性指數(shù)上可將7個(gè)樣本分為3個(gè)類別。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，香農(nóng)指數(shù)與Chao1指數(shù)和土壤磷酸酶活性為顯著相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為-0.644**和-0.506*），說明在山藥根際土壤中細(xì)菌群落的多樣性對磷酸酶活性有較大影響。

在β多樣性研究中，PCoA（Principal coordinate analysis）是基于UniFrace的主坐標(biāo)分析，可直觀顯示不同樣品中微生物進(jìn)化上的相似性或差異性。圖2顯示了在菌群β多樣性中各樣本的特征貢獻(xiàn)值，其中S5、S6、S7樣本的菌群多樣性占71.44%，為菌群多樣性的主要貢獻(xiàn)者，與α多樣性分析結(jié)果相互印證。

2.4 菌群豐度統(tǒng)計(jì)

采用LEfSe分析檢測不同組別中具有顯著豐度差異特征的菌群。從圖3a可知，除平寨村（S2）外的6個(gè)樣本在多個(gè)菌群豐度上存在顯著差異，其中放線菌、綠彎菌、酸桿菌、變形菌分別在不同組別中起重要作用，說明這幾個(gè)優(yōu)勢菌群對于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響。圖3b將7個(gè)細(xì)菌門在6個(gè)不同樣本中的門、綱、目、科、屬水平的差異信息用餅形圖表示，其中最大的變形菌門菌群類別較多（見圖3b，a1～a9，b0～b4），且差異明顯；樂平村（S6）土壤中所含細(xì)菌群落種類較豐富，且與其他樣本的差異明顯，與多樣性指數(shù)分析的結(jié)果一致。

2.5 環(huán)境因子、根莖糖類物質(zhì)與土壤細(xì)菌物種分布的相關(guān)性

CCA分析結(jié)果可反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系，從中可知影響樣品分布的重要環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子。

從圖4a可見，土壤化學(xué)指標(biāo)可聚為兩類，其中pH與樣本中細(xì)菌群落分布的相關(guān)性最大，且位于第Ⅲ、Ⅳ象限之間的軸上，與AP、AK、TOC、TN呈正相關(guān)，而與堿解氮呈負(fù)相關(guān)。

圖1 各樣本在門水平的物種相對豐度條形圖Fig.1 Relative abundances of the species of bactera in the samples at the phylum level in bar chart

圖2 樣本主坐標(biāo)分析Fig.2 Sample principal coordinate analysis

表4 α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of α diversity indices

圖4b中優(yōu)勢菌群綠彎菌、奇古菌與TOC、AK、TN、AP和pH這5個(gè)環(huán)境因子呈正相關(guān)；而酸桿菌與pH、AP呈負(fù)相關(guān)，與TOC、AK呈正相關(guān)，進(jìn)一步說明土壤pH因子是影響土壤細(xì)菌群落分布的主要環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子之一，且也是影響土壤養(yǎng)分狀況的重要因子。堿解氮單獨(dú)歸為一類，位于第Ⅱ象限，與其他環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)，與硝化螺旋菌高度正相關(guān)，說明了土壤中硝化細(xì)菌在促進(jìn)氮素同化的同時(shí)，可能對土壤中其他養(yǎng)分因子將會(huì)產(chǎn)生一定抑制作用。

圖3 菌群統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.3 Statistics chart of microflora

圖4 山藥根際土壤理化指標(biāo)與樣本及細(xì)菌群落CCA分析Fig.4 CCA analysis of soil physicochemical indexes and bacterial communities in yam rhizosphere

幾種土壤酶分別位于4個(gè)象限，相互之間的相關(guān)性表現(xiàn)不強(qiáng)（圖4b）。優(yōu)勢菌群奇古菌和綠彎菌與磷酸酶呈正相關(guān)關(guān)系；酸桿菌與蔗糖酶呈較高正相關(guān)關(guān)系，但與過氧化氫酶為負(fù)相關(guān)；硝化螺旋菌和放線菌與脲酶和過氧化氫酶均呈正相關(guān)關(guān)系，但又與磷酸酶和蔗糖酶呈負(fù)相關(guān)，說明土壤中幾種酶活性對優(yōu)勢菌群有不同程度的影響，且這種影響比較復(fù)雜，這可能跟土壤酶活性的時(shí)空異質(zhì)性［13］及菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有關(guān)。

山藥根莖中的3種糖類物質(zhì)相互之間有一定相關(guān)關(guān)系，其中淀粉與可溶性糖、粗多糖為正相關(guān)，而粗多糖與可溶性糖為弱負(fù)相關(guān)，說明粗多糖的累積一方面隨可溶性糖增加而增加，另一方面隨著粗多糖的累積可能會(huì)抑制可溶性糖的積累。優(yōu)勢菌群中奇古菌和綠彎菌與淀粉正相關(guān)，并且這兩種菌群與粗多糖為顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.54，P＜0.01）；變形菌和硝化螺旋菌與可溶性糖為正相關(guān)，與粗多糖為負(fù)相關(guān)；酸桿菌與可溶性糖的夾角幾乎呈180°，說明這個(gè)菌群與可溶性糖呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果說明在山藥根際土壤中的奇古菌和綠彎菌菌群利于多糖和淀粉的累積。

3 討 論

土壤不僅提供了細(xì)菌群落生長繁殖的微環(huán)境，其理化性質(zhì)又間接影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成。土壤微生物參與了土壤中的碳、氮等營養(yǎng)素的循環(huán)和能量流動(dòng)，參與了腐殖質(zhì)的形成、土壤結(jié)構(gòu)的形成與改良，是土壤生態(tài)的重要組分，也是植物生長及品質(zhì)形成的主要影響因子。本研究在山藥根際土壤中發(fā)現(xiàn)的4個(gè)優(yōu)勢菌群與于海玲［14］、金奇［15］的研究結(jié)果相似，均有變形菌、酸桿菌和放線菌，是多數(shù)酸性土壤中存在的菌群，這是因?yàn)橥寥兰?xì)菌群落是一個(gè)相對穩(wěn)定的系統(tǒng)，施肥或連作等條件可能只影響某些種群的豐度，而沒有改變?nèi)郝浞N類［16］。此外，這些優(yōu)勢菌群參與土壤的氮素循環(huán)［17-18］，有利于植物的生長。本研究中7個(gè)樣本的優(yōu)勢菌群基本一致，而菌群豐度及結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一定差異。

在土壤化學(xué)指標(biāo)與細(xì)菌群落關(guān)系研究中，本研究結(jié)果表明，土壤pH是影響土壤細(xì)菌群落分布的重要因子。朱平等［19］對祁連山中部4種典型植被類型土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)相關(guān)性的研究結(jié)果表明，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤pH、含水量、總有機(jī)碳和總氮呈顯著正相關(guān)，且土壤pH對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大，這與本研究結(jié)果一致。土壤細(xì)菌的影響因子大小為土壤有機(jī)碳、土壤總氮、含水量、電導(dǎo)率等，其中土壤有機(jī)碳和土壤總氮有顯著性影響［20］。王鵬等［21］的研究發(fā)現(xiàn)總磷、銨態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)含量是與細(xì)菌群落相關(guān)性較大的土壤化學(xué)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌、綠彎菌、奇古菌和硝化螺旋菌分別與土壤的總有機(jī)碳（TOC）、AK、TN、AP、AN相關(guān)，說明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受土壤化學(xué)因子的影響，與趙豐云等［22］的研究結(jié)果一致。微生物通過向土壤分泌胞外酶及死亡后細(xì)胞自溶產(chǎn)生的胞內(nèi)酶推動(dòng)土壤中的生物化學(xué)反應(yīng)，因此土壤酶活性及土壤化學(xué)指標(biāo)相互間存在著密切配合和相互促進(jìn)的復(fù)雜關(guān)系。本研究分析表明，酸桿菌與蔗糖酶和TOC均為正相關(guān)關(guān)系，蔗糖酶參與土壤中的碳循環(huán)，推測酸桿菌能夠促進(jìn)蔗糖酶活性，從而增加土壤中TOC的積累；硝化螺旋菌與脲酶和堿解氮為正相關(guān)，脲酶參與土壤中的氮循環(huán)，據(jù)此推測硝化螺旋菌通過增加脲酶活性，從而增加土壤中堿解氮含量。

本研究對山藥根莖中幾種糖類物質(zhì)含量與土壤中部分優(yōu)勢菌群相關(guān)關(guān)系的分析表明，山藥粗多糖的積累與土壤中的奇古菌和綠彎菌菌群顯著正相關(guān)。奇古菌是近20年來在中溫環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的廣泛大量存在的一類古菌，它們可能在土壤C、N的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮重要作用［23］，其中的氨氧化古菌是酸性土壤中硝化作用的主要推動(dòng)者［24］，綠彎菌通過光合作用進(jìn)行自養(yǎng)，增加土壤碳素，推測可能這些細(xì)菌通過改善土壤中的C、N循環(huán)來促進(jìn)山藥根系糖類物質(zhì)的運(yùn)輸及貯藏。綜上所述，土壤中酸桿菌、硝化螺旋菌、奇古菌和綠彎菌這4類細(xì)菌主要通過改善土壤中的碳、氮養(yǎng)分狀況，促進(jìn)山藥根莖對可溶性糖、粗多糖及淀粉的積累。

高通量測序技術(shù)對山藥根際土壤中細(xì)菌群落多樣性的分析，以及細(xì)菌群落與土壤養(yǎng)分、山藥根莖主要營養(yǎng)成分的關(guān)系分析結(jié)果顯示，它們之間存在一定相關(guān)性，但由于土壤微生物與微生物之間、與土壤養(yǎng)分之間及與植物之間存在十分復(fù)雜的相互作用關(guān)系，研究這些相互作用關(guān)系并揭示其作用機(jī)理需要進(jìn)行更加深入細(xì)致的研究，因此今后可分別就幾種優(yōu)勢菌群、菌種組合與土壤理化特征、山藥根莖營養(yǎng)成分等的互作進(jìn)行機(jī)理研究和應(yīng)用研究。

4 結(jié) 論

對山藥根際土壤微生態(tài)環(huán)境及根莖營養(yǎng)成分的研究表明，其優(yōu)勢細(xì)菌群落為變形菌、綠彎菌、酸桿菌和放線菌；土壤pH是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因子；酸桿菌和硝化螺旋菌可能通過促進(jìn)土壤中蔗糖酶、脲酶活性提高土壤的碳、氮水平，奇古菌和綠彎菌促進(jìn)根際土壤的C、N循環(huán)，增加土壤C、N養(yǎng)分，土壤中碳、氮養(yǎng)分能夠促進(jìn)山藥根莖中可溶性糖、粗多糖及淀粉的積累。