縉云山不同森林植被下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征研究*

王鎣燕 王子芳 黃 容 呂 盛 高 明

(西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715)

土壤微生物是森林土壤的重要組成部分，在有機(jī)質(zhì)形成與分解、養(yǎng)分循環(huán)與轉(zhuǎn)化以及能量流動(dòng)等方面具有重要地位［1］。其中，森林土壤微生物生態(tài)學(xué)研究，能深入了解森林土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的循環(huán)。微生物多樣性和豐度是表征微生物生態(tài)學(xué)特征的重要指標(biāo)［2］。它極易受環(huán)境參數(shù)的影響，而森林中林型、海拔、土壤性質(zhì)、溫度和水分均是至關(guān)重要的影響因子［3-4］。植被可以通過(guò)改變土壤的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（有機(jī)碳和氮）含量、含水量、溫度、通氣性以及微環(huán)境pH等關(guān)鍵環(huán)境因子來(lái)間接影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和豐度［5-6］。

目前，學(xué)者已展開(kāi)植被與微生物群落相關(guān)的研究。如Ding等［7］對(duì)神農(nóng)架林線附近灌木林和針葉林土壤微生物調(diào)查發(fā)現(xiàn)，灌木林土壤微生物群落多樣性均高于針葉林。在研究川西亞高山云杉人工林土壤微生物發(fā)現(xiàn)：林齡的增加使土壤微生物香農(nóng)多樣性指數(shù)和Pielou 均勻度指數(shù)均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)［8］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)不同植被土壤微生物的豐度存在顯著差異［9］?？梢?jiàn)植被差異對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度有重要影響。

縉云山國(guó)家森林保護(hù)區(qū)位于重慶市北部，植物種類(lèi)繁多，素有“川東小峨眉”之稱。目前該區(qū)域的研究多側(cè)重于土壤理化性質(zhì)［10-11］，少數(shù)涉及土壤微生物均采用單一分析技術(shù)或傳統(tǒng)培養(yǎng)方法來(lái)研究某種植被土壤微生物群落［9,12］，難以系統(tǒng)全面地了解該地區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度差異。結(jié)合該區(qū)域已有研究：表層土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，但易受外界環(huán)境影響［10-11］。本文運(yùn)用多種分子技術(shù)（末端限制性片段多態(tài)性分析，克隆文庫(kù)和熒光定量PCR技術(shù)）對(duì)該區(qū)域典型植被類(lèi)型（常綠闊葉林、針葉林、毛竹林、針闊混交林）表層土壤細(xì)菌、真菌和古菌群落結(jié)構(gòu)和豐度進(jìn)行定性和定量的分析，有益于了解土壤微生物與森林生產(chǎn)力及其發(fā)展演替的關(guān)系，為天然林的保護(hù)和可持續(xù)經(jīng)營(yíng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

縉云山國(guó)家森林保護(hù)區(qū)位于重慶市北碚區(qū)境內(nèi)（106°17′43″—106°24′50″E，29°41′08″—29°52′03″N；面積7 600 hm2；平均海拔951.5 m；相對(duì)高差600 m），以下簡(jiǎn)稱縉云山。屬典型的北亞熱帶溫暖濕潤(rùn)季風(fēng)氣候。年均氣溫13.6 ℃，年均降水量1 612 mm，年均日照1 294 h，年平均蒸發(fā)量777 mm。縉云山植被類(lèi)型多樣，有高等植物244科、973屬、1 861種。土壤為三疊紀(jì)須家河砂巖發(fā)育的酸性黃壤（pH 4.0～4.5）。

1.2 研究方法

2016年5月下旬選取馬尾松針葉林 （簡(jiǎn)稱針葉林，Coniferous forest）、殼斗科闊葉林（簡(jiǎn)稱闊葉林，Broadleaved-leaved forest）、馬尾松針葉/殼斗科闊葉混交林（簡(jiǎn)稱針闊混交林，Mixed broadleaf-conifer forest）以及毛竹林（P.pubescen forest）土壤為研究對(duì)象，每種植被類(lèi)型選擇3個(gè)取樣點(diǎn)，在0～20 cm土層深度取樣，按四分法進(jìn)行混勻，分別取1 kg 混后土樣，得到三等份樣品，用無(wú)菌PET樹(shù)脂袋封裝，放于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。取50 g土樣于-20 ℃冰箱保存以備分子實(shí)驗(yàn)分析，其余部分用于理化性質(zhì)分析。采樣點(diǎn)的詳細(xì)情況見(jiàn)表 1。

表1 采樣點(diǎn)基本概況Table 1 Outline of the sampling sites

理化分析土樣在室溫下自然風(fēng)干，然后研磨過(guò)篩（2 mm、1 mm、0.25 mm），基本理化性質(zhì)采用文獻(xiàn)［13］的方法進(jìn)行分析。土壤基本理化性質(zhì)見(jiàn)表2。

表2 土壤基本理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of the soils at the sampling sites

1.3 土壤總DNA提取

利用Fast DNA spin kit for soil 試劑盒（MP BIO, Inc., Irvine, CA, USA）根據(jù)制造商提供的說(shuō)明進(jìn)行提取。洗脫后總DNA體積為50 μL。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)總DNA的提取質(zhì)量（電泳條帶的單一性），同時(shí)用NanoDrop ND-1000微光分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific, USA）測(cè)定濃度。

1.4 熒光定量PCR

熒光定量 PCR技術(shù)作為核酸定量檢測(cè)技術(shù)［14］，用基因拷貝數(shù)來(lái)表征某種微生物或功能微生物的豐度，具體步驟如下：

標(biāo)準(zhǔn)樣品的制作：選用熒光定量PCR引物擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA（F357/R518）、古菌16SrRNA（U519/806R）和真菌ITS（NSI1/58A2R）區(qū)片段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化（Universal DNA Purification Kit，TIANGEN）并克?。ㄒ?jiàn)1.6）。將測(cè)序成功的陽(yáng)性克隆子提取菌液質(zhì)粒DNA（TIANprep Mini Plasmid Kit，TIANGEN），并用NanoDrop ND-1000微光分光光度計(jì)、測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度并計(jì)算拷貝數(shù)，以10倍為間隔系列稀釋成熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品。

樣品測(cè)定：將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行qPCR檢測(cè)，包括陰性對(duì)照在內(nèi)每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為：ABI Prower SybrGreen qPCR Master Mix（ABI，USA）10 mL，細(xì)菌、真菌和古菌DNA模板分別為2、4和1 mL，引物各1、0.5和1 μL（10 pmol·μL-1），加ddH2O至終體積20 mL。每個(gè)循環(huán)中熒光收集在83 ℃下進(jìn)行。熒光定量PCR分析由ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行。

1.5 末端限制性片段多態(tài)性分析

末端限制性片段多態(tài)性分析（Terminal restriction fragment length polymorphism analysis，T-RFLP）［15］具體步驟如下：

基因片段的擴(kuò)增：選用正向引物5′端帶熒光物質(zhì)FAM標(biāo)記的引物擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA(27F/1492R)、古菌 16S rRNA(Arch109F/Arch958R)和真菌ITS(ITS1F/ITS4)區(qū)片段。擴(kuò)增體系為 50 mL，后擴(kuò)增產(chǎn)物的純化和濃度測(cè)定同1.4。

產(chǎn)物酶切：采用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、HhaⅠ、RasⅠ（NEB，BioLabs）分別對(duì)細(xì)菌、真菌和古菌的純化DNA進(jìn)行單酶切，根據(jù)制造商提供的說(shuō)明進(jìn)行酶切。隨后將酶切產(chǎn)物送至送生工生物工程有限公司(上海)進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序并輸出末端限制性片段（Terminal restrictions fragments, T-RFs）圖譜［16］。

1.6 克隆文庫(kù)

選用5′端不帶熒光物質(zhì)的引物對(duì)細(xì)菌16SrRNA、古菌 16S rRNA和真菌ITS（相關(guān)引物序列和體系見(jiàn)1.5）擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化（Universal DNA Purification Kit，TIANGEN），通過(guò)pGEM-T載體(Promega)進(jìn)行克隆。根據(jù)“藍(lán)白斑”（抑制劑：X-Gal、Ampr和IPTG）對(duì)克隆子進(jìn)行篩選。每個(gè)樣品各挑取15個(gè)陽(yáng)性克隆子送至生工生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，每個(gè)樣本正確測(cè)序約10條。序列登錄號(hào)為：MG641100～MG641145；MG670412～MG670441；MG825386～MG825410；MH016246～MH016250。

1.7 數(shù)據(jù)分析

土壤理化性質(zhì)、微生物拷貝數(shù)的單因素方差分析和皮爾遜相關(guān)分析利用SPSS 21.0處理?；赥-RFLP數(shù)據(jù)，群落結(jié)構(gòu)α-多樣性指數(shù)分析，即豐富度指數(shù)（Richness，S）、均勻度指數(shù)（Evenness，J′）、香農(nóng)-威爾指數(shù)（Shannon-Weiner index，H′），利用Excel 2003完成；利用R語(yǔ)言的vegan 軟件包進(jìn)行非度量多維尺度分析（Non-metric Multidimensional scaling，NMDS）和pheatmap軟件包進(jìn)行熱圖（Heatmap）的繪制?；跍y(cè)序結(jié)果，利用Mothur軟件對(duì)序列進(jìn)行可操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units，OTU）分析，通過(guò)Mega5.0 軟件對(duì)OTU進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立。利用CANOCO軟件對(duì)土壤環(huán)境因子和微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行冗余分析(Redundancy Analysis, RDA)，并運(yùn)用蒙特卡羅置換檢驗(yàn)（Monte Carlo permutation test）去檢驗(yàn)約束排序模型的顯著性（用F值作為統(tǒng)計(jì)量）。

2 結(jié) 果

2.1 不同森林植被土壤微生物的豐度

不同森林植被土壤微生物基因拷貝數(shù)，見(jiàn)圖1。細(xì)菌、古菌16S rRNA和真菌ITS基因拷貝數(shù)范圍分別為：3.04×105～4.47×108、1.46×106～1.53×107和6.44×104～1.90×106copies?μL-1。如圖可知，真菌ITS基因拷貝數(shù)最低；針葉林土壤微生物基因拷貝數(shù)最低。此外，由單因素方差分析可知：森林植被類(lèi)型的變化對(duì)細(xì)菌和古菌影響顯著（P＜0.05）。皮爾遜相關(guān)分析顯示：細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)與pH顯著正相關(guān)（r=0.607，P＜0.05）；古菌16S rRNA基因拷貝數(shù)與含水量值顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.919，P＜0.01）。

2.2 不同森林植被土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)

基于T-RFLP分析圖譜，利用多種а-多樣性特征值表征不同森林植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，見(jiàn)表3。同一種特征值中，真菌的數(shù)值均最高。針-闊混交林土壤中細(xì)菌的群落特征值顯著高于其他植被類(lèi)型（P＜0.05）。此外，植被變化對(duì)古菌多樣性的影響最為顯著（P＜0.05）。

圖1 不同森林植被的土壤微生物拷貝數(shù)Fig.1 Copy number of the soil microbes relative to vegetation

表3 不同森林植被土壤微生物的群落特征值Table 3 Characteristics of the soil microbial community structure relative to vegetation

基于T-RFLP數(shù)據(jù)，NMDS 分析通過(guò)二維排序圖中樣點(diǎn)間距離表征不同植被類(lèi)型土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性。由圖2可知，微生物在不同森林植被土壤中的群落結(jié)構(gòu)的相似性各異。在細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)中，針葉林的樣點(diǎn)距離最遠(yuǎn)，即群落結(jié)構(gòu)最不相似。而真菌的群落結(jié)構(gòu)，針闊混交林和竹林的群落結(jié)構(gòu)最為相似。

熱圖分析能反映出不同森林植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的聚類(lèi)分析和各群落組成的相對(duì)豐度。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的聚類(lèi)分析結(jié)果與NMDS結(jié)果相同（圖3）。闊葉林的細(xì)菌種群組成最為復(fù)雜，其次為針葉林，而竹林最為單一。針闊混交林的真菌群落組分最為單一。各植被類(lèi)型間古菌的種群組成差異不明顯。

不同森林植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析，見(jiàn)圖4。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與pH、全磷和全鉀顯著相關(guān)（F分別為9.18、4.84和2.58，P＜0.05，蒙特卡羅算法）；真菌群落結(jié)構(gòu)與全鉀、有效磷和速效鉀顯著相關(guān)（F分別為2.28、2.15和5.83，P＜0.05，蒙特卡羅算法）。古菌群落結(jié)構(gòu)與全磷、速效鉀和全鉀顯著相關(guān)（F分別為2.56、1.20和1.35，P＜0.05，蒙特卡羅算法）。

2.3 不同森林植被土壤微生物系統(tǒng)發(fā)育地位分析

圖2 不同森林植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的 NMDS 分析Fig.2 NMDS analysis of the soil microbial community structure relative to vegetation

不同森林植被土壤微生物系統(tǒng)發(fā)育分析見(jiàn)圖5a-c。細(xì)菌有48個(gè)OTU；真菌有33個(gè)OTU；古菌有31個(gè)OTU；由圖5a可知：縉云山地區(qū)的細(xì)菌種類(lèi)十分豐富，包括9個(gè)細(xì)菌門(mén)。針葉林中包含的細(xì)菌種類(lèi)最單一，無(wú)優(yōu)勢(shì)種類(lèi)。闊葉林和針-闊混交林土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群分別為：Chloroflexi（4/13）和Acidobacteria（7/15）。竹林土壤細(xì)菌的種類(lèi)最為豐富，其中Gamma-proteobacteria（4/15）為優(yōu)勢(shì)種群，且Firmicute和Bacteroidetes為獨(dú)有種群。由圖5b可知，針闊混交林中真菌只有Ascomycota（7/7）。竹林和針葉林沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)種群。在闊葉林土壤中的優(yōu)勢(shì)種群為Zygomycota（8/10）。由圖5c可知，竹林中包括兩個(gè)古菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)古菌為T(mén)haumarchaeota（7/11）。針闊混交林的古菌中Thaumarchaeota（7/14）在三種菌中占優(yōu)勢(shì)。針葉林和闊葉林分別包括2種和3種古菌門(mén)，且均與其他植被下古菌的種類(lèi)有明顯差別，尤其是針葉林，即它包括很大部分的未知古菌（5/10）。

圖3 不同森林植被土壤微生物群落組成相對(duì)豐度分析Fig.3 Relative abundant analysis of the soil microbial community structure relative to vegetation

圖4 不同森林植被土壤微生物群落的RDA排序圖Fig.4 RDA ordination analysis of the soil microbial community structure relative to vegetation

3 討 論

本文采用熒光定量PCR技術(shù)定量分析不同森林植被類(lèi)型土壤微生物豐度的差異。本文中不同植被土壤的微生物豐度不存在絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在已有森林土壤微生物豐度的研究中也得到相同結(jié)論［17-19］。Siles和Margesin［17］研究發(fā)現(xiàn)，高原森林土壤中細(xì)菌的拷貝數(shù)最高，真菌次之，古菌最低。而此結(jié)果與本文中細(xì)菌最高，古菌次之，真菌最低的結(jié)果相悖。這可能是由于微生物群落對(duì)環(huán)境條件(如水、氣、熱等生態(tài)因子) 的偏好性以及不同氣候區(qū)、不同森林類(lèi)型下土壤性質(zhì)的差異［20-21］。本研究中，針葉林各微生物豐度明顯低于其他植被類(lèi)型，這與傳統(tǒng)微生物學(xué)方法研究縉云山不同林分下微生物的豐度結(jié)果類(lèi)似［9］。微生物豐度與土壤理化性質(zhì)間的相關(guān)性研究眾多，Bardelli等［18］研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的拷貝數(shù)受到pH的影響，而真菌幾乎不受環(huán)境影響，以上結(jié)果與本文相同；但古菌的拷貝數(shù)與pH和C/N含量顯著有關(guān)，與本文相異。但已有研究給出合理解釋：縉云山地區(qū)是季風(fēng)氣候，季節(jié)性降水直接影響土壤中的pH和C/N［11］，所以古菌受水分含量顯著影響也是可信的。

T-RFLP技術(shù)研究不同森林植被土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。本文研究顯示：真菌的群落結(jié)構(gòu)最豐富，且香農(nóng)-威爾多樣性指數(shù)顯示古菌多樣性受植被影響最顯著，該結(jié)果與已有研究存在差異［22］。一方面是因?yàn)楦邼舛葰潆x子抑制細(xì)菌生長(zhǎng)［23］。本實(shí)驗(yàn)土壤偏酸性，這就解釋了為何真菌群落結(jié)構(gòu)略高于細(xì)菌。另一方面，植被品種有直接影響。如Lynch等［24］研究不同樹(shù)種下微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：雖然木黃麻和桉樹(shù)均為喬木，但桉樹(shù)分泌的有毒的酚醛樹(shù)脂和萜烯使其土壤中微生物群落更易受影響。本文中闊葉林的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，這與柳春林等［25］結(jié)果相似。不同森林植被土壤中細(xì)菌、真菌和古菌均表現(xiàn)出差異，但程度不同與前人研究相同［18,22,26］。

系統(tǒng)發(fā)育分析得出不同森林植被優(yōu)勢(shì)土壤微生物種群。本文闊葉林土壤微生物的優(yōu)勢(shì)種群（Chloroflexi、Zygomycota）與已有研究不一致，但已有研究也沒(méi)有確定的結(jié)論［22,27-28］。這直接表現(xiàn)出闊葉林植物品種對(duì)微生物的影響［24］。本文中針闊混交混林和竹林中優(yōu)勢(shì)種群（Acidobacteria、Gamma-proteobacteria；Ascomycota；Thaumarchaeota）與前人所得結(jié)果完全相異［16,22］，間接地表現(xiàn)出縉云山地區(qū)的針闊混交林和竹林的微生物群落有明顯的特異性。文中T-RFLP和克隆技術(shù)在體現(xiàn)細(xì)菌群落組成上有一定程度的差異，主要是T-RFLP分析中自動(dòng)排除了一些豐度較低的細(xì)菌種群，而克隆在挑取克隆子時(shí)可控性小，可能挑取到豐度低的種群。所以兩種分子技術(shù)綜合應(yīng)用能幫助我們得到更可信的結(jié)果。

CANOCO軟件中RDA分析可研究環(huán)境因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響［8,26,29］。微生物群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子多為pH、全氮和有機(jī)碳［8,26,29］，因?yàn)橛袡C(jī)碳是微生物的主要能源物質(zhì)［30］，而氮的有效性常抑制微生物的生長(zhǎng)活性［31］。但本研究中影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子除pH外還有鉀、磷元素。首先，相對(duì)于有機(jī)碳和氮因素，鉀、磷元素的限制掩蓋了它們的作用。其次，縉云山森林地區(qū)受亞熱帶季風(fēng)影響，雨水眾多易造成土壤中鹽基離子（K+）被淋洗，使土壤pH 濃度普遍偏低［11］。而酸性環(huán)境會(huì)使P生成難溶性物質(zhì)不能被微生物利用［32］。以上均可能是造成K、P元素成為抑制微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)展的原因。

4 結(jié) 論

本研究利用多種分子技術(shù)得出縉云山國(guó)家森林保護(hù)區(qū)內(nèi)4種植被類(lèi)型土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的變化規(guī)律。針葉林土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)最為獨(dú)特，但豐度最低。真菌的多樣性最高，但豐度優(yōu)勢(shì)不明顯。在眾多森林土壤環(huán)境理化性質(zhì)中，除了pH， K、P元素同樣是制約微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)展的主要環(huán)境因子。不同植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度均存在明顯地差異，這種差異與林型、土壤環(huán)境存在密切的關(guān)系，在一定程度上反映了各植被土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化狀況、土壤肥力水平和穩(wěn)定性。對(duì)天然林的保護(hù)和持續(xù)經(jīng)營(yíng)有一定理論與實(shí)際意義。