淺談CRISPR-Cas9技術在現代醫學前沿領域的相關應用

李美琪

摘要：肺癌是人類常見的惡性腫瘤，發病率全球腫瘤中第一，發病率和死亡率也逐年增高。而最新研究表明通過CRISPR-Cas9技術可有效敲除基因中NFE2L1轉錄因子，中從而證實NFE2L1跨膜因子在腫瘤發生、胚胎發育中起著重要作用，CRISPR-Cas9技術為相關研究找到可重大突破口。G6PD缺乏癥是最常見的一種遺傳性酶缺乏病，全球約2億人患有此病。有研究表明可通過CRISPR-Cas9對突變位點進行切割修復以達到治療效果。由此可見，CRISPR-Cas9技術可通過對基因精確編輯來為諸多疾病治療提供了更加廣闊的思路。

關鍵詞：CRISPR-Cas9技術? ?G6PD缺乏癥? ?肺癌

近50年來，肺癌患者數量急劇上升，死亡率也明顯增高。根據世界衛生組織國際癌癥研究機構近日發布最新報告顯示：2018年肺癌死亡人數高達180萬人，占預計癌癥死亡總人數的18.4%。我國G6PD缺乏癥也是高發病，在我國各地患病率為0.2%～44.8%，全世界約2億人患此病。近年來，CRISPR-Cas9技術與遺傳病之間聯系研究日益增多。我國于2016年也開展CRISPR-Cas9基因編輯技術治療肺癌疾病的臨床實驗。本文對CRISPR-Cas9技術在肺癌及G6PD缺乏癥的臨床研究中的應用展開論述。

一、CRISPR-Cas9技術

（一）CRISPR-Cas9技術由來

生物公司EditasMedicine開發出了一種CRISPR-Cas9的基因治療法，其可通過對DNA進行精確地序列剪切、作技術來治療多種疾病。基因編輯是目前生命科學研究的一個熱點，而CRISPR-Cas9是當今最流行的基因編輯工具，其在人類生物學、業及多個領域發揮著重要作用。2016年，中國科學家有望開展首個CRISPR-Cas9基因編輯臨床實驗 ，將由四川大學華西醫院腫瘤學家盧鈾教授及其研究小組帶對利用CRISPR-Cas9基因編輯技術敲除基因再回輸入患者體內用以治療肺癌。2017年，英國《自然通訊》雜志發表通過利用CRISPR-Cas9系統可拯救失明小鼠的重要遺傳學研究成果，證實了CRISPR-Cas9在遺傳病中的重要應用。

（二）CRISPR-Cas9技術原理

CRISPR-Cas9系統最早被發現于古生菌中，并且廣泛存在于細菌中，是抵御外來遺傳物質入侵的重要免疫機制。可將外源侵染物整合保存，該外源侵染物再次侵染細菌時，CRISPR及其相關蛋白會通過剪切破壞外源基因以保護細菌。CRISPR-Cas9由一系列成簇規律間隔的短回文重復序列組成。CRISPR-Cas9系統主要由在DNA分子上成線性排列的tracrRAN序列、as基因序列和CRISPR三個功能區構成。CRISPR-Cas9發生免疫系統原理為：Cas9蛋白可有效地對gRNA導介的特定位點進行編輯，將外源基因整合到自身基因中，具有核酸內切酶的作用。Cas9首先與一個gRNA結合并通過gRNA引導結合到DNA目標位點，識別的位點會受到DNA序列限制即Cas9識別靶序列后滿足NGG序列。NGG序列也可稱為PMA原型間隔序列毗鄰基。這是CRISPR至關重要的一部分，PMA是一段高度保守的序列，Cas9只對位于PMA5端附近的靶序列進行切割，在識別靶向DNA中起著重要作用。整合后的CRISPR序列首選轉錄為pre-crRNA再與tracrRNA形成復合物，并通過Rnase切割形成crRNA從而完成crRNA的轉錄加工。該過程中crRNA通過靶基因互補配對的方式來保持基因特異性。通過科學探究發現，人們可以利用Cas蛋白發揮核酸內切酶活性切斷外源基因的機理，若除去Cas蛋白核酸內切酶活性，形成dCas蛋白，則可阻礙靶細胞轉錄以實現基因靜默，從而對多項基因研究工作提供了渠道。

（三）CRISPR-Cas9技術展望

CISPR-Cas9使用起來簡單，易于設計且成本低等優點，從而替代了以往生物學家利用的分子工具編輯基因組技術。分子具編輯基因組技術中有一種鋅指核酸酶技術有望精確高效編輯基因，但其價格昂貴并未廣泛使用。而CRISPR-Cas9卻有著決定性的優勢，因為該序列衍生的RNA可引導蛋白質結合到特定DNA片段，從而引起目標DNA上的雙鏈斷裂，簡單高效。研究人員只需要訂購RNA片段，花費明顯降低，并且與鋅指核酸酶技術相比，CRISPR-Cas9基因編輯技術的設計和構建難度明顯降低，且CRISPR-Cas9可同時進行多靶編輯，靶向修飾率也大大提高。因此，CRISPR-Cas9技術被廣泛應用于生物醫學研究。

任何事物都有利弊CRISPR-Cas9技術也不例外。CRISPR-Cas9技術雖然被應用到世界各國眾多科學研究中，與此同時它也有所弊端，即使sgRNA可以精確定位，Cas9蛋白可以精確識別RNA序列，但也會有失誤的時候——脫靶。各項基因工程研究都避免不了脫靶現象，這影響了編輯效率，也會造成一定的風險。目前，雖然不能完全消除脫靶現象的存在，但可以通過優化sgRNA、提高Cas9蛋白自身特異性等方法降低脫靶率。雖然CRISPR-Cas9技術使用上有些阻礙，但依舊不可否認，CRISPR-Cas9技術為生物體研究和改造帶來的巨大貢獻。

二、CRISPR-Cas9技術在醫學中應用

（一）G6PD缺乏癥

CRISPR/Cas9 系統作為新一代基因編輯工具，其強大的基因編輯能力不僅在遺傳性疾病研究中有所突破，并且在臨床試驗中也被積極展開應用，如杜氏肌營養不良，Crygc基因突變引發的白內障等疾病中的應用。目前，CRISPR-Cas9技術正在嘗試應用于G6PD缺乏癥的臨床研究中。G6PD缺乏癥主要分為新生兒黃疸、急性溶血癥貧血、慢性非球形紅細胞溶血行貧血三類，全世界約有4億G6PD缺乏癥患者，主要分布在東南亞、非洲和地中海沿岸等地，并且男性患者明顯多于女性。我國廣東、海南等地人群的患病率較高。我國人群中已發現G6PD基因突變位點超過20種。G6PD缺乏癥患者紅細胞表面G6PD缺乏而引發的一系列反應，從而導致紅細胞破壞并溶血。根據G6PD酶的活性缺乏程度及臨床表現分為五種亞型。

1.CRISPR-Cas9技術在G6PD缺乏癥中具體應用

SPENCER等人利用CRISPR-Cas9技術培養G6PD基因敲除細胞系，研究發現G6PD基因敲除細胞系的G6PD表達下降，這證明了CRISPR-Cas9技術可用于編輯G6PD基因組。TANG等向單細胞人胚胎中注射恰當的sgRNA和同源供體復合的Cas9蛋白，證明G6PD基因中點突變可由有效的同源重組來介導校正。根據CRISPR-Cas9系統編輯原理，PAM區上游的3～8堿基處的目的基因可由sgRNA引導Cas9蛋白切割，即大部分G6PD缺乏癥突變位點可通過CRISPR-Cas9技術修復，如我國常見的幾種突變95A>G、1376G>T、1024C>T等。人工設計特異性sgRNA來引導的Cas9蛋白針對導致G6PD缺乏癥突變點進行切割，提供DNA修復模板進行同源修復以便修復突變位點，也可將G6PD缺乏癥患者體細胞重編輯為iPSCS，將G6PD缺乏癥患者來源的iPSCS中的致病突變基因通過CRISPR-Cas9技術進行修復，最終將修復后的iPSCS誘導分化為紅系祖胞移植到G6PD缺乏癥患者體內，以治療G6PD缺乏癥。CRISPR-Cas9系統作為遺傳性疾病的新型治療技術具有無限大的潛力和廣闊的應用前景。

（二）腫瘤研究

腫瘤吸煙、大氣污染和煙塵中含有致癌物質等因素有關，威脅人類生命健康的原因有惡性程度高、高耐藥性等。而近期研究發現跨膜轉錄因子NFE2L1在癌癥中扮演著抑癌基因的重要角色。NFE2L1又稱NRF1，屬于堿性亮氨酸拉鏈之一。其在胚胎發育、腫瘤發生等研究中發揮著重要作用。有實驗表明，利用CRISPR-Cas9技術將成年小鼠肝細胞內NFE2L1基因敲除后會引發自發性脂肪肝并持續惡化為肝癌死亡，可見，NFE2L1在抑癌中的關鍵作用。

1.CRISPR-Cas9技術在腫瘤疾病中應用

肺癌是一種細胞惡性增殖疾病，而NFE2L1對癌細胞增殖能力進行調節，且由實驗結果分析，在敲除NFE2L1后進行腫瘤細胞增殖培養48小時后，腫瘤細胞增值明顯。NFE2L1信號通路可誘導其下游調控的多種抗氧化酶表達，是細胞內重要的內源性抗氧化防御調節機制之一。NFE2L1與肝臟疾病的發生發展有著密不可分的關系。CRISPR-Cas9是細菌適應性防御系統，可特異性切割外源基因、準確地進行基因編輯。利用CRISPR-Cas9技術研究基因缺失與腫瘤表現型之間的關系，為腫瘤研究治療樹立了新的方向。根據Ren等研究結果顯示NFE2L1在肝正常細胞表達明顯高于在肝癌細胞中的表達，即可證明NFE2L1發揮著抑癌因子作用。EMT重新編輯被認為是胚胎形成所必需的基礎，若使用CRISPR-Cas9技術敲除胚胎發育期小鼠的NFE2L1基因，則小鼠會死亡，可見EMT轉化在胚胎發育、細胞癌變轉移中發生。在過腫瘤細胞發展初期通過EMT轉化，并獲得其離開原發腫瘤的能力，進入周圍組織并擴散到機體內，最終導致對集體損傷。CRISPR-Cas9技術可對DNA序列進行編輯，促進NFE2L1轉錄因子的表達，從而調節細胞增殖、凋亡及血管生成有關生化反應。

三、結語

隨著基因編輯技術迅速發展CRISPR-Cas9技術在肺癌研究領域及多種遺傳疾病研究領域發揮著重要作用，也對疾病的發生發展機制提供了巨大便利。CRISPR-Cas9技術作為一個重要基因編輯工具也被應用到眾多實驗研究中。近期，CRISPR-Cas9技術在肺癌相關研究中成功檢查出NFE2L1有抑癌因子的作用，規范了以后研究工作。目前，也有研究學者構想出了通過CRISPR-Cas9技術編輯基因突變位點從而治療G6PD缺乏癥等遺傳疾病，為遺傳疾病治療開拓了空間，并且奠定了理論基礎。CRISPR-Cas9技術雖相對其他基因編輯技術有構建成本低、靶向修飾效率高、可進行多靶點同時編輯等優勢，但CRISPR-Cas9仍存在安全性、脫靶效應和特異性等問題需要解決，這對胚胎或配子的可遺傳基因組編輯所帶來的風險仍無法估測。但是不可否認CRISPR-Cas9技術有著廣泛的應用前景，生物醫學科研機構和實驗室可對CRISPR-Cas9技術進行完善和拓展，使CRISPR-Cas9技術應用到更多領域。

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（作者單位：沈陽市第一中學）