基于核酸檢測的蝦過敏源標準物質研究

李春 高運華 王治棟 黃文勝

摘要：選擇最常食用的海產對蝦作為蝦過敏源標準物質的候選物，提取并純化其基因組DNA，采用序列測定法對設定的目標基因成分進行定性鑒定。用數字PCR技術精確確定海蝦16S基因、蝦真核生物18S基因、胡蘿卜真核生物18S基因的拷貝數，以胡蘿卜基因組DNA為本底，重量法配置蝦16S基因拷貝數滇核生物18S基因組拷貝數比值為1%。評定蝦16S基因拷貝數/真核生物18S基因拷貝數比值的定值不確定度，擴展不確定度為0.09%。并利用數字PCR儀對配置的標準物質進行特性量值驗證，結果一致性良好?？蔀榛诤怂釞z測的食物過敏源標準物質的研制提供方法參考。

關鍵詞：核酸檢測;蝦;過敏源;標準物質

中圖分類號：TS207;Q52 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）09-0049-05

收稿日期：2019-02-15;收到修改稿日期：2019-03-31

基金項目：國家質量研發重點專項項目（2017YFF0204604）;國家質檢公益行業科研專項（201510026）;標準物質平臺項目（32-APT1802-12）

作者簡介：李春（1994-），男，安徽長豐縣人，碩士研究生，專業方向為核酸定量分析。

通信作者：高運華（1972-），男，山東菏澤市人，副研究員，主要從事核酸計量技術與標準研究工作。

0 引言

為有效預防和控制食物過敏給人類健康帶來的危害，食物過敏源的檢測、診斷以及治療已成為國內外研究的熱點[1-3]。檢測過敏源成分的方法主要有兩類，一是檢測過敏源蛋白質，二是檢測過敏源基因殘留[4-6]。檢測過敏源蛋白質方法直接，但是當過敏蛋白含量極低時，很容易被食品的基質所掩蓋，同時不同過敏源之間有部分相同的抗原決定簇會發生一定的交叉反應，容易造成檢測的誤差[7-8]。檢測過敏源基因殘留方法并不直接針對食品中的過敏源進行檢測，而是通過分析食品中是否還有該過敏源物種的基因成分，從而推測該產品是否含有該物種的過敏源[9-12]。我國發布過系列過敏源PCR檢測方法標準，該標準方法基于擴增反應，靈敏度非常高，痕量的物種殘留即可檢出，為基于基因殘留檢測的過敏源檢測提供了方法標準[13-14]。但是，非常高的靈敏度，也使PCR檢測方法在某些產品上會出現假陽性，如大豆油作為大豆的油脂一般不含有大豆蛋白過敏源，但PCR方法也可以檢測出大豆基因的物種殘留，給出陽性判定。因此，檢測過敏源蛋白質和檢測過敏源基因殘留兩種方法均有局限性，而法定的、具有特定量值的過敏源標準物質是過敏源成分檢測結果準確有效保證。

食物過敏標準物質是解決食物過敏檢測問題的關鍵材料之一。美國國家標準與技術研究院（NIST）研制了8種過敏性食物標準物質;歐盟資助的EuroPrevall項目構建了一個食物過敏源信息的數據庫，而CREATE項目則首次證實重組花粉過敏源rBet v1可作為天然花粉過敏源Bet v1的候選標準物質，為開發重組食物過敏源標準物質提供了一種借鑒。國內外基于過敏源殘留基因檢測的技術標準方法越來越多，但相對應的標準物質現在還不多，世界各國正積極研制相對應的標準物質。我國食物過敏源蛋白和核酸檢測的標準物質研究正積極開展，食物過敏源標準物質將為我國食物過敏源蛋白和核酸檢測結果的有效性、法制性和溯源性提供強有力的物質和技術支撐。本文以最常食用的蝦為候選物，以胡蘿卜為本底，用數字PCR方法測定蝦和葫蘆卜特異基因拷貝數，重量法配制1%水平的蝦一胡蘿卜基因組標準物質，利用數字PCR和熒光定量PCR方法對配制的標準物質特性量值進行了驗證，為基于核酸檢測的食物過敏源標準物質的研制提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器設備

冷凍干燥儀：熱電，Biosafer-18D，（美國）;數字PCR儀：Bio-Rad QX 200（美國）;實時熒光定量PCR儀：LightCycler 480Ⅱ（美國）;電子天平：梅特勒XSE 205DU（瑞士）：超速冷凍離心機：Sigma3K30（德國）;超純水系統：Milliber Q S（美國）。

1.2 材料試劑

基因組DNA提取試劑盒：天根生化DP323中國）;動物組織基因組DNA提取試劑盒：天根生化DP324（中國）：PCR擴增試劑盒：ABI4369016（美國）;數字PCR擴增試劑：Bio-Rad（美國）;數字PCR擴增試劑：Fluidigm Biomark qdPCR 37K^TMIFC（美國）;甲醇（色譜純）、乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純）。

1.3 基因組DNA提取及純度分析

采用商業化提取試劑盒的技術方案提取基因組DNA，采用紫外分光光度法對基因組DNA含量（OD260吸收值）和DNA純度（OD260/OD280比值）進行了檢測;另外，利用瓊脂糖凝膠電泳方法對基因組DNA的完成性和相對含量進行了檢測。

1.4 數字PCR方法

通過文獻及國家現行標準的比較分析[13-14]，優化建立了蝦過敏源標準物質的PCR擴增條件和引物探針體系，用優化建立的數字PCR擴增條件和反應體系對蝦基因組DNA中目標基因片段，蝦和胡蘿卜基因組DNA中真核基因片段進行了定量擴增，用于標準物質特性量值的確定、均勻性檢驗、穩定性考察。

2 結果與討論

2.1 基因組提取DNA純化分析

以商品化的基因組DNA提取試劑盒為基礎，提取蝦和胡蘿卜的基因組DNA，利用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法對純化后的基因組DNA進行了純度分析，結果見表1和圖1。

由表1可知，純化后的基因組DNA OD260/OD280介于1.8～2.0之間，樣本純度較高;由朗伯比爾定律可知，DNA濃度與OD260紫外吸收值成正比，OD260吸收值1對應于雙鏈DNA50ng/μL。提取的基因組DNA用數字PCR進行檢驗，沒有抑制效應，可以用于標準物質的定值分析。

分析圖1可知，提取的基因組DNA純度較高，蛋白質和RNA殘留較少，滿足了定量PCR和數字PCR檢測的需要，可用于標準物質定值分析。

2.2 目標基因擴增條件

通過文獻及國家現行標準的比較分析最終確定了蝦過敏源標準物質的PCR擴增條件和引物探針體系[13-14]，PCR擴增熱循環條件：50℃ 2min;95℃變性、UNG酶失活10min;95℃變性15s，60℃退火延伸1min，50個循環。引榭朵針體系見表2，PCR反應體系為TaqMan Universal PCR Master Mix（2×）10μL;引物400nmol/L，1μL：探針400nmol/L，1μL：去離子水6μL;DNA模板2μL;總反應體系20μL。

引物探針的特異性和靈敏度良好，熱循環條件合適，可以有效擴增出目標基因條帶。該反應條件可用于標準物質特性量值的定值確定和均勻性檢驗、穩定性考察。

2.3 標準物質均勻性檢驗

均勻性是標準物質的固有特性之一，即在規定的細分范圍內其特性保持不變。按照國家計量技術規范JJF1343-2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》中對標準物質均勻性評估的技術要求，隨機抽取15個包裝單元，用數字PCR方法檢測目標基因的拷貝數濃度進行標準物質均勻性檢驗。采用F檢驗法對均勻性測量數據進行了統計檢驗，結果見表3。由表可知研制的標準物質樣品均勻一致，符合標準物質研制均勻性的要求。

2.4 標準物質穩定性考察

標準物質的穩定性是指在規定的時間間隔和環境條件下，標準物質的特性量值保持在規定范圍內的性質。過敏源標準物質穩定性檢驗采用數字PCR方法進行測定。依據JJF1343-2012推薦的標準物質穩定性評價方法進行標準物質穩定性檢驗及評價，檢驗結果見表4，分析可知在12個月時間內標準物質特性量值無顯著性變化，符合標準物質的穩定性要求，檢驗結果為穩定。

2.5 標準物質的定值

基因組DNA采用本文建立的數字PCR方法進行目標基因拷貝數的絕對定量檢測，確定了蝦16S基因和真核生物18S基因，葫蘆卜真核生物18S基因的拷貝數。依據JJF1343-2012的要求和ISO導則34的要求，采用重量法配制過敏源基因組DNA標準物質，確定的標準值為拷貝數百分比值，為1%蝦16S滇核生物185=1%。

2.6 標準物質的定值不確定度分析

定值結果不確定度主要從目標基因拷貝數數字PCR定量、標準物質的重量法配制、標準物質的不均勻性、標準物質的不穩定性等部分進行了考察。具體考察分析的不確定度來源魚骨刺圖見圖2。

2.6.1 不確定度的量化

目標基因拷貝數數字PCR測量不確定度（UM）主要包括數字PCR校準、儀器穩定性、測量重復性3部分。儀器校準由校準證書得到，將其轉化為相對標準物質不確定度計人標準物質特性量值的不確定度，儀器的穩定性和測量重復性由多次測量結果的相對標準偏差表示。標準物質重量法配制和樣品的稀釋配制產生的不確定度（u_B）主要體現在天平稱量方面，主要包含天平本身的不確定度和多次稱量重復性兩部分。不均勻性帶來的不確定度（u_H）和不穩定性帶來的不確定度（u_T）根據ISO導則35規定的計算方法進行計算。具體的量化結果見表5。

2.6.2 合成標準不確定度

以上不確定度分量互不相關，則合成標準不確定度為

蝦過敏源標準物質合成標準不確定度為：u_{蝦16S/真核18S}=4.3%。

2.7 定值結果

定值結果表示為：標準值士擴展不確定度。取包含因子k=2，則擴展不確定度可以表示為U=k×u。蝦過敏源定值結果為1.01%±0.09%。

3 數字PCR驗證

將研制好的標準物質用數字PCR方法進行了特性量值驗證，結果列于表6。

由表中數據可知，數字PCR的測量值與重量法配制值能夠很好的符合，由此說明，數字PCR進行目標基因拷貝數的精確定量，然后根據需要采用重量法配制成需要的不同目標基因比值的標準物質是可行的。由于數字PCR方法是不依賴于外標準的絕對定量方法，現在越來越多的應用到目標基因的定量分析中，也逐漸成為基于目標基因定量的核酸標準物質權威定量方法;而重量法可以很好的實現設定基因比率樣本的配制，且選擇精度良好的天平可以有效減少重量法配制給標準物質特性量值帶來的不確定度影響;因此，數字PCR和重量法結合很好的實現了不同物種間不同目標基因檢測標準物質特性量值的確定，且準確度較高。

4 結束語

針對過敏源檢測急需的目標基因檢測標準物質稀缺問題，本文研究建立了基于數字PCR技術的目標基因拷貝數濃度確定方法，測定了蝦16S基因和真核生物18S基因，葫蘆卜真核生物18s基因的拷貝數，然后利用重量法配制了蝦16S基因/真核生物18S基因DNA配比標準物質;評定了定值結果的不確定度，為基于目標基因檢測的過敏源標準物質的研制提供了方法借鑒。

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（編輯：莫婕）