茶多酚對壬基酚所致白鯽魚胚胎發育毒性的改善作用

陳建華，謝艷穎

（福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117）

【研究意義】 壬基酚聚氧乙烯醚（NPEOs）是目前全球商用第二大類的非離子表面活性劑，被廣泛應用于工業（造紙、紡織、橡膠、塑料等）、農業（農藥乳化劑等）以及日常生活（清洗劑、服裝、化妝品等）中。在NPEOs生產和使用過程中，其降解產物壬基酚(nonylpheol，NP) 最終經工業廢水、生活污水和城市污水等多種渠道進入水環境中[1]。進入水環境中的NP降解困難，現有對NP的處理方法不能實現水體NP的完全轉化，水體中的痕量NP可以通過水生生物的高度富集而擴大濃度，從而對水產魚類多臟器及胚胎發育產生毒性，降低魚類的生育能力，導致魚類品質下降、減產及魚苗繁殖困難；此外，因富集而擴大濃度的NP還可以通過食物鏈進入人體，進而影響人類健康。研究資料表明，在長江、珠江等多條江河水系、水產品的養殖用水、池塘，甚至人們的飲用水中都檢測到NP的存在，在常食深海魚油的婦女乳汁和性早熟患兒血清中也都檢測到NP[2-7]。NP通過染毒水產魚類、降低其品質進而危害人類健康的風險客觀存在。在目前無法完全去除水環境NP的條件下，對NP所致水產魚類胚胎毒性作用的改善研究將有利于水產魚類品質、產量的提高及優質魚苗的培育。【前人研究進展】 研究表明，生物體內，有毒物質的代謝將產生大量活性氧，當機體內活性氧不能被及時清除時，可引起機體的氧化應激，導致抗氧化酶活性的改變和膜脂質過氧化的損傷，從而對機體產生損傷[8]。一定量的NP能導致海洋微藻、蛤蜊抗氧化系統的破壞，表明壬基酚誘發機體活性氧的形成導致抗氧化系統的損傷是壬基酚誘發水生生物毒性反應的機制之一[9-11]。【本研究切入點】 茶多酚是茶葉中提取出來的天然物質，占茶葉干重的15%～25%，不僅具有抗畸變、防癌抗癌的能力，對機體活性氧自由基和脂類自由基也具有顯著的清除能力，此外茶多酚還是一種優良的解毒劑，能拮抗外源污染物等化學物質對肝、腎的損傷并保護機體免受化學物質的致畸作用[12-15]。劉振興等[16]發現，在飼料中添加一定量的茶多酚可以顯著提高羅非魚的生長性能和免疫力，表明魚飼養中添加茶多酚具有可行性。【擬解決的關鍵問題】 利用白鯽魚胚胎為研究材料，研究NP對白鯽魚胚胎的毒性影響，同時探討茶多酚對NP所致白鯽魚胚胎毒性的改善作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生白鯽魚親魚于繁殖季節（2017、2018年3—4月）在閩江捕獲，分別進行預試驗和正式試驗，試驗地點為福建師范大學動物實驗室。催產激素LRHA2和 DOM購自寧波第二激素制品廠。NP（化學純）購自南京奧多福尼生物科技有限公司，用無水乙醇（分析純）助溶，配制成250 mg/mL。茶多酚（純度＞95%）購自天津希恩思生化科技有限公司。挑選性成熟雌雄魚進行人工催產，混合注射，自然產卵受精，取受精后24 h的健康胚胎進行試驗。試驗期間水溫18～20 ℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 NP對白鯽魚胚胎的毒性試驗 試驗設清水對照、溶劑乙醇對照和NP染毒處理。根據預試驗結果，NP染毒處理設3個質量濃度梯度（ 0.04、0.40、4.00 mg/L），每個質量濃度設2次重復，每個重復隨機放置200個胚胎。每隔24 h半量更換試驗用水，試驗用水均以預先曝氣48 h的自來水配置，試驗容器為24.5 cm×24.5 cm×9 cm的塑料盆，內置2 L試驗用水進行充氣孵化。每天觀察并記錄胚胎發育情況，卵凝結或心臟停止搏動為胚胎死亡標志。于受精后7 d按以下公式統計胚胎孵化率及幼魚畸形率:

1.2.2 茶多酚對NP所致白鯽魚胚胎毒性的改善試驗 根據NP毒性試驗結果，選取一定濃度的NP液為NP對照，在此基礎上添加不同濃度的茶多酚進行毒性改善試驗。按照10倍稀釋的方法將茶多酚配置成 0.35、3.50、35.00 μg/L 3個濃度處理。每個處理2次重復，每個重復隨機放置200個胚胎。具體方法參照1.2.1。

試驗數據運用SPSS 11.0系統軟件進行單因素方差分析，利用線性回歸分析NP的染毒劑量與效應關系。

2 結果與分析

2.1 茶多酚對NP所致白鯽魚胚胎孵化毒性的改善

2.1.1 NP對白鯽魚胚胎孵化的毒性作用 結果（圖1）表明，與清水對照相比，溶劑乙醇對胚胎的發育不僅沒有抑制作用，還顯著提高了胚胎的孵化率，這可能與乙醇抑制水霉菌的生長、改善胚胎孵化環境有關。與溶劑乙醇對照相比，中、低濃度（0.04～0.40 mg/L）NP能顯著降低白鯽魚胚胎的孵化率，高濃度（4.00 mg/L）NP對白鯽魚的胚胎毒性強，孵化作用影響明顯，胚胎接觸高濃度NP 24 h后即發生心跳停止、血循環終止，表現為停育現象，其7 d孵化率為0。

圖1 NP對胚胎孵化的影響Fig.1 Toxic effects of NP on embryo hatching

2.1.2 茶多酚對胚胎孵化的改善作用 選取0.40 mg/L的NP為基礎液，在此基礎上添加不同濃度的茶多酚進行胚胎孵化的改善試驗，結果（圖2）表明，低濃度（0.35 μg/L）的茶多酚處理胚胎的孵化率與NP對照沒有顯著差異，中濃度（3.50 μg/L）的茶多酚處理胚胎的孵化率比NP對照顯著提高，而高濃度（35.00 μg/L）茶多酚處理胚胎的孵化率明顯低于中濃度（3.50 μg/L）茶多酚處理，與NP對照沒有明顯差異，表明僅適當濃度（3.50 μg/L）的茶多酚能提高胚胎的孵化。

圖2 茶多酚對胚胎孵化的改善Fig.2 Improvement of embryo hatching by tea polyphenols

2.2 茶多酚對NP所致白鯽魚胚胎發育畸形的改善

2.2.1 NP對白鯽魚胚胎發育的影響 胚胎染毒24 h的發育觀察結果顯示，清水對照、溶劑乙醇對照和低、中濃度（0.04～0.40 mg/L）NP染毒處理的胚胎中絕大多數發育正常，可觀察到胚胎卵膜內具有明顯的視泡與尾部，尾部卷縮細長達頭部，身體背面皮膚、腹腔壁、卵黃囊表面覆蓋大量分散的黑色素，頭部下方搏動的心臟清晰可見，且有紅色的血液流至心臟（圖3A）。但高濃度（4.00 mg/L）NP對胚胎的致畸作用強烈，染毒24 h后即表現為胚胎尾部明顯的發育不良，發育停滯于心跳期，光學顯微鏡下可以觀察到高濃度（4.00 mg/L）NP中胚胎具有明顯的視泡，心臟內可見紅色血液，但不見血液流動及心臟跳動，尾部發育不完全（圖3B）。

胚胎染毒48 h后，仔魚開始陸續孵化出膜，剛孵出的仔魚喜歡側臥靜止，多數仔魚形態正常，顯微鏡下可以觀察到其尾部筆直，背鰭、臀鰭、尾鰭鰭褶相連呈薄膜狀；黑色素斑點已遍布頭部、背部、軀干部；心臟正常跳動，血液周身循環（圖4A）。少數仔魚存在發育畸形，主要表現在：卵黃囊水腫，卵黃囊明顯大于正常仔魚的卵黃囊，表現出明顯的卵黃囊吸收延遲現象（圖4B）；脊柱往一側彎曲，或者呈 “S”形彎曲（圖4C）；尾部向背部一側翹起彎曲（圖4D）；斷尾上翹同時伴有卵黃囊吸收延遲的現象（圖4E）；尾部發育不良，長度明顯短于正常仔魚尾部（圖4F）。

圖3 染毒24 h的胚胎Fig.3 Embryos exposed for 24 h

圖4 NP染毒后孵化仔魚的畸變形態Fig.4 Abnormal shapes of larval exposed to NP

對受精7 d的仔魚畸形率統計顯示，溶劑乙醇對照仔魚畸形率與清水對照沒有顯著性差異，說明溶劑乙醇對白鯽魚沒有明顯的致畸作用，而中、低濃度（0.04～0.40 mg/L）的NP對孵化仔魚具有顯著的致畸作用（圖5），且孵化仔魚的畸形率與NP濃度呈正相關。以NP染毒濃度為橫坐標，對孵化仔魚的畸形率進行回歸分析，其方程式為：Y=7.59X -3.88 （R=0.94，P＜0.01），相關關系經統計學檢驗具有極顯著意義。

2.2.2 茶多酚對NP所致胚胎發育畸形的改善 在0.40 mg/L的NP基礎液中加入不同濃度茶多酚后發現，與NP對照相比，在本試驗的濃度范圍（0.35～35.00 μg/L）內茶多酚均能明顯降低仔魚的畸形率（圖6）。

綜上所述，NP對白鯽魚胚胎的發育具有一定的毒性作用，不僅顯著降低胚胎的孵化率，而且顯著性提高孵化仔魚的畸形率，高濃度的NP能迅速導致胚胎停育；在NP中加入適量茶多酚不僅能顯著提高白鯽魚的孵化率，還能顯著降低NP所致白鯽魚仔魚的畸形率。

圖5 NP對孵化仔魚的致畸毒性Fig.5 Abnormal rate of larval induced by NP

圖6 茶多酚對胚胎發育畸形的改善Fig.6 Improvement of the abnormal rate by tea polyphenols

3 討論

NP在水體中廣泛存在，其對水生生物的胚胎發育毒性具有普遍性，目前已知 NP對斑馬魚、玫瑰無須鲃、金魚等魚類的胚胎發育具有毒性。然而不同魚種的胚胎對NP的敏感性并不一致。張慧等[17]對斑馬魚胚胎毒性的試驗顯示，僅高濃度的NP 才能顯著降低斑馬魚的孵化率并導致尾部畸形率和心包囊腫率增多，而中、低濃度NP對斑馬魚受精卵的發育沒有顯著性影響。金魚胚胎毒性試驗結果表明，雖然低濃度NP對金魚的囊胚和原腸胚發育沒有明顯影響，但能造成胚胎尾部脊索的彎曲，而高濃度NP對胚胎毒性強，引發胚胎出現畸形增多、卵凝結及死亡等異常情況[19]。玫瑰無須鲃胚胎對NP敏感性高，即使低濃度的NP也能對玫瑰無須鲃的受精卵產生毒性，引發受精卵發育延遲和脊椎畸形；高濃度的NP對玫瑰無須鲃毒性強烈，受精卵僅處理2h即發生胚盤損失和卵黃渾濁，繼而出現卵凝結而死亡[18]。本試驗利用NP對白鯽魚胚胎進行染毒，發現白鯽魚胚胎對NP同樣敏感，中低濃度的NP不僅降低了胚胎的孵化率，而且還顯著提高了孵化仔魚的畸形率，高濃度NP對白鯽魚胚胎毒性極強，直接導致胚胎的停育，NP對白鯽魚胚胎發育的這種毒性影響，與玫瑰無須鲃的胚胎毒性試驗結果非常類似。

不同發育時期的胚胎對NP敏感性的不同是影響胚胎發育結果的原因之一。一般認為魚類受精卵在早期卵裂過程中，由于胚胎細胞處于高度分裂期，此時的胚胎對外界環境高度敏感，外環境的有毒物質往往通過影響細胞分裂而導致卵裂終止和胚胎死亡。卵凝結和發育停滯是NP對卵裂期胚胎發育毒性的主要表現形式。囊胚期和原腸胚的胚胎對NP的敏感性比受精卵卵裂期的胚胎弱一些，雖然NP造成囊胚期和原腸胚的胚胎發育時間有所延遲，但是形態學上沒有很明顯的變化，可能的原因是這兩個時期細胞主要進行內陷、外包等運動行為[18]。當胚胎發育進入成體節期時，由于這個時期脊索和神經管正在形成，因此外界有毒物質的存在將導致脊椎畸形和神經管形成障礙，具有這類缺陷的胚胎或者不能孵化出來，或者攜帶各種缺陷孵化出來，主要表現為尾部彎曲、短缺或卵黃囊腫大等畸形。本研究預試驗對受精卵直接染毒并修復進行分析，發現茶多酚對受精后馬上染毒的胚胎沒有明顯的修復作用，故正式試驗所用的胚胎材料為受精后約24～26 h的尾芽期胚胎。此期胚胎的早期器官雛形已經形成，在解剖鏡下可見初步的大腦已分化，眼囊清晰可見，胚體尾部呈圓錐狀尾芽，尾鰭和體節等尚未完全形成，因此這個時期的胚胎在接觸NP后，僅對脊椎和體節的形成造成障礙，導致胚胎孵化率的降低及各種尾部畸形增多。

許多研究認為NP對生物體的毒害與NP誘發機體產生過量氧自由基有關[19-25]，而茶多酚諸多的生物學功能中，清除自由基、抗氧化能力尤為突出。因此本試驗在NP基礎液中加入適量茶多酚后能顯著提高白鯽魚胚胎的孵化率，并降低孵化仔魚的畸形率，這可能與低濃度茶多酚改善胚胎的氧化損傷有關[26-31]。

4 結論

NP對白鯽魚胚胎具有一定的發育毒性，不僅導致胚胎孵化率降低，而且引起孵化仔魚畸形率增加，而在NP中添加適量的茶多酚能改善NP引發的白鯽魚胚胎發育毒性，使得胚胎孵化率增加，孵化仔魚畸形率下降。