躍變型果實貯藏淀粉降解研究進展

蕭允藝，姚祥濱，劉杰鳳，李 穎

（1.廣東石油化工學院廣東省嶺南特色果蔬加工及應用工程技術研究中心/廣東普通高校食品科學創(chuàng)新團隊，廣東 茂名 525000；2.廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術開發(fā)中心，廣東 茂名 525000）

淀粉是果實重要的貯藏碳水化合物，由直鏈淀粉（10%～25%）和支鏈淀粉（75%～90%）兩類葡萄糖聚合物組成[1-2]。前者為由葡萄糖殘基以α -1,4-糖苷鍵首尾聚合而成的無分支的直鏈分子，后者則是葡萄糖殘基以α-1,4-糖苷鍵及α-1,6-糖苷鍵聚合而成的帶分支長鏈。非晶體結構的直鏈淀粉和支鏈淀粉相互作用形成的晶體結構最終形成不溶于水的半晶體顆粒，即淀粉粒[3-4]。淀粉按功能可分為暫時淀粉和貯藏淀粉，暫時淀粉分布在葉片等“源”組織中，白天光合作用形成暫時淀粉，晚上暫時淀粉降解，為葉片呼吸作用和進一步的蔗糖合成提供底物并轉移到植物的“庫”[5-6]。

貯藏淀粉分布在果實、種子、塊根、塊莖、鱗莖等非光合作用細胞質體（造粉體）中，用于中期或長期貯藏，當植物需要時，會重新降解利用，如谷物類種子萌發(fā)所需的能量主要由貯藏的淀粉水解獲得[7-9]。某些躍變型果實在成熟前含有大量的貯藏淀粉，如香蕉[10]、獼猴桃[11-12]、芒果[13]、鱷梨[14]等，在采后成熟過程中淀粉降解作為果實提供呼吸代謝的底物并形成風味影響果實的食用品質。

淀粉降解的主要產物為麥芽糖和葡萄糖，它們都可以被運送至質體外為細胞代謝利用[15]。淀粉的降解為非光合器官維持持續(xù)的碳水化合物供應，對于植物正常生長和適應生長環(huán)境至關重要[2]。果實淀粉降解對于果實風味品質形成，尤其是呼吸躍變型果實，在采后成熟過程中，淀粉含量會隨著呼吸躍變急劇下降[10]。為此，我們近年來幾種高貯藏淀粉的躍變型果實淀粉降解的研究進展，概括其淀粉降解參與的酶基因及其存在的轉錄調控因子，以期了解果實貯藏淀粉降解的特點，為今后果實淀粉降解基礎研究提供理論依據和研究方向。

1 植物暫時淀粉降解

在模式植物擬南芥葉片淀粉降解研究表明，葉片暫時淀粉降解由多種酶蛋白共同參與完成（圖1）[16]，這些酶基因缺失或沉默都會導致淀粉過量表型，主要包括：葡聚糖水合雙激酶（Glucan water dikinase，GWD）[17]、磷酸化葡聚糖水合雙激酶（Phosphoglucan water dikinase，PWD）[18]、雙特異性磷酸酶（Dualspecificity phosphate,DSP4，又名Starch excess 4，SEX4）[19]、磷酸化酶LSF1/2 (Like SEX Four 1/2)[20]、α-淀粉酶（α-amylase，AMY）[21]、β-淀粉酶（β-amylase，BAM）[22-23]、異淀粉酶（isoamylase，ISA）[24]、極限糊精酶（Limit dextrinase，LDA）、α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase，PHS）[25]、4-α葡聚糖轉移歧化酶（4-α-glucanotransferase Disproportionating enzyme，DPE）[26-27]、麥芽糖轉運蛋白（Maltose transporter，MEX）[28]及葡萄糖轉運蛋白（Glucose transporter，pGlcT）[29]以及淀粉粒相關功能蛋白早期饑餓蛋白（early starvation1，ESV1）和類早期饑餓蛋白（Like Early Starvation1，LESV）[30]等。擬南芥葉片淀粉降解的基礎研究為其他模式植物以及果實貯藏淀粉降解提供充足的參考價值。

圖1 擬南芥葉片淀粉降解示意圖Fig.1 Sketch map of starch degradation in Arabidopsis leaves

2 貯藏淀粉降解研究

果實是植物貯藏淀粉的重要器官之一，如未成熟的香蕉、獼猴桃、蘋果等躍變型果實中都含有大量淀粉[12,31-32]。淀粉在果實生長發(fā)育期慢慢積累并在成熟過程中降解為可溶性糖，使果實甜度上升。目前報道參與果實淀粉降解的酶基因只在番茄、獼猴桃、蘋果和香蕉等水果中少數報道（表1），但相關的遺傳規(guī)律和調控機制尚無深入研究。

表1 躍變型果實淀粉降解相關基因匯總Table 1 Summary of genes related to starch degradation in climacteric fruits

2.1 番茄果實淀粉降解

在番茄果實發(fā)育過程中，淀粉含量達到最大值后，淀粉開始水解，淀粉合成速度低于降解速度，當果實到達著色期（Color break）時，淀粉基本完全降解[33]。然而早期早番茄果實淀粉降解的相關研究未受到關注，在花粉淀粉降解的研究則有所進展，利用轉座子插入技術突變表達番茄LeGWD基因（legwd:Ds），使得番茄雄性不育，突變后的番茄花粉顯示出sex表型，抑制了花粉萌發(fā)，研究結果說明葡聚糖磷酸化酶參與花粉淀粉的降解過程[34]。后來果實淀粉降解的相關研究才開始被重視，MARIA等[35]發(fā)現β-淀粉酶活性隨著番茄成熟淀粉降解及可溶性糖含量上升而提高，推測3個β-淀粉酶基因（bAmy1/2/3）參與淀粉的水解。最新研究發(fā)現，SlWHY1蛋白通過調節(jié)淀粉降解，增強番茄植株耐冷性但未見影響番茄果實淀粉降解報道[36]。而香蕉轉錄因子MaMYB3在Micro-Tom小番茄過表達結果顯示，番茄果實中淀粉降解相關基因SlGWD1、SlPWD1、SlLSF2、SlBAM1,SlAMY3和 SlAMY4表達下調，淀粉降解受阻延緩果實成熟[32]。總而言之，番茄果實淀粉降解關鍵酶基因的挖掘及功能驗證研究欠缺，還需進一步篩選驗證。

2.2 蘋果果實淀粉降解

研究發(fā)現，在蘋果果實發(fā)育過程中，β-淀粉酶和α-淀粉酶活性活性變化與淀粉含量大致呈現互為消長的趨勢，推測它們參與了果實質體中淀粉的降解過程[37-38]。而果實淀粉降解受到乙烯抑制劑1-MCP顯著抑制，嘎拉蘋果果實軟化的初始階段，淀粉降解對果實軟化的影響最顯著，并伴隨淀粉酶(AM)活性和MdAM基因表達的快速上升，且淀粉含量、AM活性及它們與硬度的相關性均顯著受到低溫和乙烯因子的調節(jié)，表明淀粉降解與嘎拉蘋果果實軟化關系密切[39]。DOERFLINGER等[40]以兩個蘋果品種（McIntosh、Empire）為試材，在果實采收前1周處理1-MCP或2、4周前分別處理AVG，發(fā)現Empire果實采后貯藏過程中淀粉降解延遲，但不能阻止淀粉的最終降解。蘋果作為我國北方主產水果之一，控制貯藏條件，果實可以進行將近一年時間的貯藏，貯藏過程中淀粉的降解與其耐貯性關系還需更多證據。

2.3 獼猴桃果實淀粉降解

獼猴桃果實采后成熟過程中淀粉降解，并伴隨著可溶性糖（葡萄糖、果糖和蔗糖）含量上升[41-42]。采收后的果實淀粉含量在室溫下隨時間延續(xù)而下降，乙烯加劇淀粉的降解，而低溫能有效延緩貯藏過程中淀粉水解酶活性上升從而有效緩解淀粉降解。研究發(fā)現，有24個基因與獼猴桃（Actinidia deliciosa）淀粉降解相關，其中AdAMY1，AdAGL3和AdBAM3.1/3L/9受乙烯誘導與淀粉降解正相關并受氣調貯藏抑制，推測這5個基因參與獼猴桃采后成熟過程中淀粉的降解[42]。陳景丹等[43]研究發(fā)現相似結果，紅陽獼猴桃（Actinidia chinensis）采后淀粉降解與果實軟化密切相關，乙烯能通過調節(jié)AcPWD、AcAMY1、AcAMY3、AcBAM1和AcABAM3的表達，進而促進淀粉降解和果實軟化，而外源1-MCP作用相反。最新研究發(fā)現在獼猴桃葉片中穩(wěn)定過表達AdBAM3L能有效降低葉片淀粉含量，說明其是獼猴桃淀粉降解的關鍵酶基因，另外，轉錄因子AdDof3通過結合AdBAM3L的啟動子并激活表達，從而參與果實淀粉降解的調控[11]。獼猴桃果實淀粉的降解與果內軟化密切相關，不但在關鍵酶基因篩選上進行了探究，還在轉錄調控層面發(fā)現關鍵調控轉錄因子，豐富了果實淀粉降解的網絡，為其他果實淀粉降解研究提供參考。

2.4 香蕉果實淀粉降解

香蕉果實發(fā)育過程中，淀粉慢慢積累起來，可達到干重的60%～90%[44-45]，采后成熟過程中迅速降解轉化為可溶性糖，淀粉含量從呼吸躍變前的22%鮮重降到躍變后的1%鮮重[46]。果肉淀粉降解是果實硬度下降的一個重要因素，因為淀粉不但作為細胞的主要貯藏物，還是呼吸能量源，為細胞呼吸躍變及乙烯誘發(fā)的高速細胞壁代謝提供前提條件，最終果實衰老軟化。香蕉果肉淀粉降解的早期研究主要是發(fā)現與淀粉降解相關的酶基因：α-淀粉酶基因MAmy[47]，淀粉去分支酶基因Maisa[48]和β-淀粉酶基因Mabmy[49]。近年研究表明β-淀粉酶在大蕉和巴西蕉果實淀粉降解中起關鍵作用[50]。另外最新轉錄水平和蛋白組研究發(fā)現，香蕉參與果肉淀粉降解的38酶基因，并有27個酶基因受乙烯誘導表達提高。同時發(fā)現MabHLH6能結合并激活 MaGWD1、MaLSF2、MaBAM1、MaBAM2、MaBAM8、MaBAM10、MaAMY3、MaAMY3C、MaISA2，MaISA3和MapGlcT2-2等11個淀粉降解相關基因的啟動子，是響應果實成熟淀粉降解起關鍵作用的轉錄激活子[10]。后續(xù)研究進一步發(fā)現，一個MYB類轉錄因子MaMYB3可以靶定MabHLH6和10個淀粉降解相關酶基因的啟動子，并抑制其轉錄表達。在番茄中超表達MaMYB3，發(fā)現番茄果實中淀粉降解相關基因表達下調，淀粉降解受阻延緩果實成熟，揭示了MaMYB3通過直接抑制淀粉降解相關基因和MabHLH6，參與調控果實成熟[32]，豐富了香蕉降解的網絡，如圖2所示。

圖2 香蕉淀粉降解調控網絡Fig.2 Degradation regulation network of banana starch

3 果實淀粉降解研究展望

在人們生活水平不斷改善的今天，水果糖含量備受農業(yè)和消費者關注，因此關于各種果實在發(fā)育成熟和采后衰老過程中淀粉的降解調控作用機理是目前研究的熱點。果實成長發(fā)育至采后成熟是一個動態(tài)的生命活動過程，前階段果實主要是果實淀粉積累，后階段以果實淀粉降解為主。果實淀粉降解由一系列酶基因參與完成，同時受果實成熟相關眾多影響因素在轉錄水平和轉錄后水平調控。果實淀粉降解研究雖然起步較晚，但是依靠目前成熟的轉錄組測序、蛋白組測序、代謝組質譜分析和基因定點敲除等研究手段，未來十年，果實淀粉降解研究將迎來重大發(fā)展和突破。

3.1 果實淀粉降解研究的不足之處

作為果實研究的模式植物，番茄果實淀粉的降解研究存在較大空白，涉及果實淀粉降解的酶基因還未被完全挖掘。香蕉和獼猴桃作為高淀粉水果，淀粉降解的研究在近幾年才有所突破，不過目前還未涉及遺傳規(guī)律研究。果實淀粉降解的調控是一個復雜過程，涉及多種轉錄水平，轉錄后水平以及翻譯后水平的多層次、多階段的協(xié)同作用（圖3）。因此目前研究某個或少數幾個轉錄因子調控淀粉降解仍不足以闡明果實淀粉降解的復雜調控網絡。

圖3 多層次果實常數降解研究思路Fig.3 Research idea of mutti-level degradation of fruit starch

3.2 果實淀粉降解與非果實淀粉降解的異同

非果實淀粉主要包括葉片暫時淀粉和組織貯藏淀粉兩種存在形式。葉片暫時淀粉是葉片通過光合作用在葉綠體中合成臨時儲備碳源，并可通過降解為葡萄糖和麥芽糖長距離運輸到植物其他部位。而組織貯藏淀粉多貯藏于塊莖或塊根細胞淀粉體和種子胚乳中，作為組織器官的營養(yǎng)物質，以備生長所需，如塊莖和種子萌芽。如馬鈴薯淀粉體中的淀粉降解主要發(fā)生在以下兩種情況：一種是馬鈴薯低溫貯藏過程中淀粉降解糖化，導致還原糖積累。另外是貯藏淀粉降解為塊莖發(fā)芽提供必需的營養(yǎng)物質[54]。淀粉降解主要通過淀粉磷酸化途徑和淀粉水解，其過程包括可溶性葡聚糖的釋放、可溶性和線性葡聚糖的降解和麥芽糖代謝3個階段。目前研究發(fā)現馬鈴薯α-淀粉酶活性主要由StAmy23引起，β-淀粉酶活性主要由StBAM1和tBAM7引起，冷藏塊莖中的淀粉酶抑制劑可以調節(jié)淀粉酶的活性[55]。

果實淀粉降解與葉片暫時淀粉降解具有更多相似之處，淀粉降解相關的酶在淀粉貯藏細胞中合成，參與淀粉降解相關的酶種類相似，但是葉片淀粉降解受光照調控啟動，而果實淀粉降解不受光照影響，而受一系列激素（尤其是乙烯）誘導調控。另外，谷物種子胚乳是死細胞組織，降解淀粉所需的酶由盾片或者糊粉層（包圍在胚乳表面的一層活細胞）合成并釋放到胚乳中，又或者是β-淀粉酶在種子發(fā)育時就形成貯藏在胚乳中，后經種子萌發(fā)時被活化起作用。然而目前研究發(fā)現，只有三種淀粉降解相關的酶參與胚乳淀粉的降解，分別是：α-淀粉酶[56]、β-淀粉酶[57]、DBE（極限糊精酶，LD）[58]。雖然 GWD 和PWD都存在于谷類種子中，種子貯藏淀粉粒上只檢測到非常低水平的共價連接的磷酸鹽，也沒有足夠的ATP去維持循環(huán)的磷酸化作用[59]。因此，谷類淀粉降解與葉綠體暫時淀粉和果實貯藏淀粉的降解的機理有明顯不同。

3.3 果實淀粉降解的調控研究思路

轉錄因子參與果實發(fā)育成熟的研究越來越受到關注，此類核小蛋白在果實成熟發(fā)育過程中起到杠桿效果[60]。在線轉錄因子數據庫（PlantTFDB 4.0[61]和iTAK[62]）并結合表達譜數據分析結果，可以讓研究者獲得大量的與果實降解同步表達差異轉錄因子，為后期闡明果實淀粉降解的復雜轉錄調控網絡提供最基礎的數據。

隨著蛋白組測序技術的高速發(fā)展，翻譯后水平的蛋白修飾調控也備受研究者青睞，如蛋白泛素化測序、組蛋白乙酰化測序、蛋白磷酸化測序等。蛋白質泛素化是體內具有重要生物學功能的蛋白質翻譯后修飾之一，體內泛素化和去泛素化的動態(tài)平衡，是調控蛋白質降解和維持細胞蛋白穩(wěn)態(tài)的關鍵機制，對蛋白質的定位、代謝、功能調節(jié)和降解中都起著十分重要的作用[63]。蛋白質磷酸化是一種非常重要且廣泛存在的翻譯后修飾調控方式，參與細胞的增殖、發(fā)育、分化、凋亡，細胞骨架調控、新陳代謝等，對許多生物的細胞功能起著生物“開/關”作用[64]。蛋白質乙酰化參與了幾乎所有的生物學過程，如轉錄、應激反應、新陳代謝以及蛋白合成與降解等，除了對核內轉錄調控因子的激活外，對蛋白質的功能也產生很大影響，包括酶的活化與失活、蛋白質穩(wěn)定性、亞細胞結構定位和特殊功能復合體的形成等[65]。

同時，通過質譜分析，不但可以知道蛋白是否發(fā)生修飾，而且可以確定修飾的位點及程度。為果實淀粉降解參與調控的轉錄因子或蛋白的深入研究提供平臺支持。

另外，定點突變技術CRISPR自2014在番茄中便開啟應用，此后，CRISPR-Cas9系統(tǒng)已成功應用于柑橘、黃瓜、蘋果、葡萄、西瓜、獼猴桃、香蕉等作物[66]。此技術的推廣將為果實淀粉降解的研究提供強大的科研工具，將大大促進構建完善的果實淀粉降解的調控網絡，挖掘關鍵的轉錄因子或者蛋白修飾調控組分。總而言之，研究果實淀粉降解，將豐富果實采前和采后生物學的理論，有助于利用基因工程或者其他手段改進果實的保鮮技術。