蒸汽爆破輔助提取油茶籽蛋白及其功能性質分析

張善英，徐魯平，鄭麗麗，艾斌凌，鄭曉燕，楊 旸，潘永貴，盛占武

(1.中國熱帶農業科學院 海口實驗站, ?？?570102； 2.海南大學 食品學院， ?？?570228；3.海口市香蕉生物學重點實驗室，海口570102)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)是我國特有的重要食用油樹種，主要在我國華南地區分布和種植，油茶籽年產量超過2.5億kg[1]。油茶籽粕是油茶籽提油后主要的副產品，油茶籽粕含有12%～15%的蛋白質[2]。油茶籽蛋白具有較高的經濟價值，可用作原料進行發酵生產菌體蛋白飼料[3]和蛋白酶[4]。當前，油茶籽蛋白提取的方法主要有傳統堿溶酸沉法、超聲輔助提取以及水酶法提取等[5-6]，單純的堿溶酸沉法蛋白質提取率低，酶法主要用于實驗室生產，并且酶法和超聲處理都存在成本高等缺點。

蒸汽爆破原理是在高溫和高壓過程中，高飽和蒸汽瞬間釋放到環境中并迅速降溫，使生物材料受到破壞產生低相對分子質量的化合物，被廣泛用于材料預處理。當前蒸汽爆破技術也被應用到蛋白質提取方面，蒸汽爆破可以提高高溫豆粕蛋白質提取率，改變蛋白質的理化性質和結構，增強其親水性[7]。將蒸汽爆破與堿溶酸沉法相結合提取花生蛋白，其蛋白質提取率由41.8%提高到52.6%，并且蛋白質的起泡性、乳化性、持水性等都得到顯著提高[8]。

本文將蒸汽爆破技術與堿溶酸沉法結合提取油茶籽中的蛋白質，研究堿溶酸沉提取油茶籽蛋白的工藝條件，并從pH、NaCl濃度、蔗糖濃度、蛋白質量濃度等外在因素方面研究蒸汽爆破前后油茶籽蛋白的功能性質的變化，為油茶籽蛋白在食品中的進一步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

油茶籽、大豆油，市售；石油醚(沸程60～90℃)、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、氫氧化鈉等，分析純。

QBS-80 蒸汽爆破機，河南省鶴壁正道生物能源有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計，島津儀器有限公司；數顯恒溫水浴振蕩器；AL-104型精密電子天平；電熱恒溫水浴鍋；S20K pH計。

1.2 實驗方法

1.2.1 油茶籽的蒸汽爆破處理

將干燥油茶籽放入蒸汽爆破機中，在壓力0.8～2.3 MPa下處理30～120 s得到汽爆油茶籽。

1.2.2 油茶籽粕的制備

經汽爆處理與未汽爆處理的油茶籽粉碎后過40目篩，用水代法(料液比1∶4.5，pH 9，溫度75℃，時間150 min)提取油茶籽油后，將所得的油茶籽粕冷凍干燥，完全收集并保存于-20℃，待分析。

1.2.3 油茶籽蛋白等電點的確定

稱取適量未汽爆處理油茶籽粕樣品，樣品與蒸餾水質量體積比為1∶20，用1 mol/L 的NaOH調其pH至11。在水浴溫度40℃下浸提40 min。以8 000 r/min離心10 min后取上清液，用1 mol/L HCl分別將上清液pH調為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，靜置60 min后離心 (8 000 r/min，10 min)，棄上清液，沉淀冷凍干燥后稱重。

1.2.4 堿溶酸沉法提取油茶籽蛋白

取適量干燥后的油茶籽粕按一定的料液比加入蒸餾水，用1 mol/L的NaOH 調節pH，在水浴搖床中以不同的溫度提取一定時間后，8 000 r/min 離心10 min，用1 mol/L HCl調節上清液的pH至等電點。室溫靜置沉淀2 h后離心(8 000 r/min，10 min)，去除上清液，用去離子水洗沉淀至中性，透析袋透析除雜48 h,冷凍干燥沉淀后得油茶籽蛋白。油茶籽蛋白提取率按下式計算。

油茶籽蛋白提取率=m1/m2×100%

式中：m1為提取的油茶籽蛋白質量，g；m2為原料中油茶籽蛋白質量，g。

1.2.5 油茶籽蛋白吸水性與吸油性分析

吸水性：取0.5 g油茶籽蛋白樣品于離心管中，加入10 mL蒸餾水，振蕩5 min后靜置30 min，8 000 r/min離心15 min，棄上清液，稱量試管內容物質量。

吸油性：準確稱取0.5 g油茶籽蛋白樣品于離心管中，加入5 mL大豆油，振蕩5 min后靜置30 min，再以8 000 r/min離心15 min，棄上清液，稱量試管內容物質量。

1.2.6 油茶籽蛋白起泡性及泡沫穩定性分析

蛋白質量濃度的影響：稱取適量油茶籽蛋白樣品于100 mL蒸餾水中，使蛋白質量濃度分別為1、2、3、4、5 g/100 mL，調節油茶籽蛋白溶液pH為7。

pH的影響：稱取1.0 g油茶籽蛋白于100 mL蒸餾水中，用1 mol/L HCl或NaOH溶液調至不同的pH (2、4、6、8、10)。

NaCl濃度的影響：稱取1.0 g油茶籽蛋白樣品溶于100 mL pH 7的濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl溶液中。

蔗糖濃度的影響：稱取0.5 g油茶籽蛋白，分別加入100 mL 濃度分別為0、3、5、7、9 mol/L的蔗糖溶液，調節pH為7.0。

將上述處理樣品于30℃水浴保溫靜置10 min。然后以8 000 r/min均質2 min，快速測量均質停止時泡沫的體積(V1)。繼續在30℃水浴條件下保溫，10 min后繼續測量泡沫體積(V2)。按下式計算起泡性和泡沫穩定性。

起泡性=V1/100×100%

泡沫穩定性=V2/V1×100%

1.2.7 油茶籽蛋白乳化性與乳化穩定性分析

蛋白質量濃度的影響：稱取適量油茶籽蛋白樣品于50 mL蒸餾水中，調節蛋白質量濃度分別為1、2、3、4、5 g/100 mL，調節溶液pH為7。

pH的影響：稱取0.2 g油茶籽蛋白于50 mL蒸餾水中，用1 mol/L HCl或NaOH溶液調至不同的pH (2、4、6、8、10)。

NaCl濃度的影響：稱取0.2 g油茶籽蛋白樣品溶于20 mL pH 7的濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液中。

蔗糖濃度的影響：稱取 0.1 g 油茶籽蛋白，分別加入 20 mL濃度分別為0、3、5、7、9 mol/L的蔗糖溶液，調節pH 為7.0。

在上述處理樣品中分別加入體積分數為25% 的大豆油，以8 000 r/min攪拌乳化1 min，形成均一的乳化液，立即從底部取50 μL該乳化液，加入5 mL 0.1%的SDS溶液，迅速搖勻后立即測定樣品在500 nm波長處的吸光度(A0)(以SDS溶液為空白)，10 min后再從底部取50 μL乳化液，稀釋同樣倍數，測定吸光度(A10)。 乳化性以A0表示，乳化穩定性指數(ESI)按下式計算。

ESI=A10/(A0-A10)×t

式中：t為靜置時間，10 min；A0為均質后0 min 乳化液吸光度；A10為均質后10 min乳化液吸光度。

2 結果與分析

2.1 油茶籽蛋白等電點(見圖1)

圖1 油茶籽蛋白等電點測定結果

由圖1可知，當pH在2.0～5.0之間時，油茶籽蛋白的沉淀量隨著pH的增大先增大后減小，當pH為3.0時，沉淀量達到最大，為0.443 7 g。因此，確定油茶籽蛋白等電點為3.0。

2.2 油茶籽蛋白提取工藝的研究

2.2.1 料液比對油茶籽蛋白提取率的影響(見圖2)

由圖2可知，隨著料液比的增大，油茶籽蛋白提取率下降。這可能是因為過多的水使油茶籽粕中非蛋白類物質溶出增加，從而影響蛋白質的溶出。經汽爆處理的油茶籽蛋白提取率顯著高于未汽爆處理的，這可能是因為蒸汽爆破屬于高溫高飽和蒸汽過程，破壞了油茶籽的結構，并且瞬時高溫有助于促進蛋白質聚集，加劇蛋白質的溶出，提高了蛋白質提取率[9]。

注：pH 11，提取溫度40℃,提取時間40 min。與未汽爆處理相比，*為差異顯著,P<0.05，**為差異極顯著，P<0.01。下同。

圖2 料液比對油茶籽蛋白提取率的影響

2.2.2 pH對油茶籽蛋白提取率的影響(見圖3)

注：料液比1∶10，提取溫度40℃，提取時間40 min。

由圖3可知，油茶籽蛋白提取率隨著pH的增大先上升后下降，當pH為10時，油茶籽蛋白提取率最大，汽爆處理與未汽爆處理的油茶籽蛋白提取率分別為(63.33±0.67)%和(56.17±1.79)%，隨著pH的繼續增大，油茶籽蛋白提取率下降。pH過大會使蛋白質變性，顏色加深甚至變黑、產生不良氣味[10]，并且，當pH過高時，酸沉過程則需要消耗大量的酸，從而產生大量的鹽，不利于蛋白質的沉淀分離且增加了提取成本。因此，油茶籽蛋白的最佳提取pH為10。

2.2.3 提取時間對油茶籽蛋白提取率的影響(見圖4)

由圖4可知，隨著提取時間的延長，油茶籽蛋白提取率隨之增大，在50 min之前，油茶籽蛋白提取率增幅較大，但當提取時間超過50 min，油茶籽蛋白提取率基本趨于穩定。在提取初期，提取時間短，蛋白沒有完全溶出，隨著提取時間延長蛋白不斷溶出，當蛋白溶出達到一定量，即使時間繼續延長蛋白質提取總量不會再發生顯著變化。從節約成本角度來看，選擇提取時間50 min最為適宜。此時汽爆處理油茶籽蛋白提取率為(68.14±1.68)%，是未汽爆處理的1.20倍。

注：料液比1∶10，提取溫度40℃，pH 10。

2.2.4 提取溫度對油茶籽蛋白提取率的影響(見圖5)

注：pH 10,料液比1∶10，提取時間50 min。

由圖5可知，隨著提取溫度的升高，油茶籽蛋白提取率增加，但超過40℃后油茶籽蛋白提取率下降。隨著溫度升高提取體系的黏度降低，分子間相互作用減弱從而蛋白質溶出增加；當溫度繼續升高可能會引起部分蛋白質變性，蛋白質提取率下降，因此選擇40℃為最佳提取溫度，此時未汽爆處理油茶籽蛋白提取率為(58.74±1.45)%，汽爆處理油茶籽蛋白提取率為(71.01±1.13)%。

綜上所述，油茶籽蛋白最佳提取條件為：料液比1∶10，pH 10，提取時間50 min，提取溫度40℃。

2.3 油茶籽蛋白功能性質

2.3.1 吸水性和吸油性

蛋白質吸水性和吸油性對食品具有重要意義，可通過油和水以及蛋白的相互作用來改善食品的風味和口感[11]。汽爆處理和未汽爆處理的油茶籽蛋白吸水性分別為(10.8±0.06)g/100 g和(9.35±0.05)g/100 g，吸油性分別為(15.6±0.1)g/100 g和(10.8±0.05)g/100 g，均相對較好。經汽爆處理后，油茶籽蛋白的吸油性和吸水性顯著提高，可能是因為蒸汽爆破使更多包裹于蛋白質中的親水基團和親脂基團暴露，增加了基團之間與脂質和水之間的作用力。

2.3.2 起泡性與泡沫穩定性

2.3.2.1 pH的影響(見圖6)

圖6 pH對起泡性與泡沫穩定性的影響

由圖6可知，未汽爆處理與汽爆處理油茶籽蛋白起泡性均隨著pH的增加而增大。pH在2～4時，起泡性增幅較小，可能是因為在等電點附近時，凈電荷量較少，可溶解的蛋白質濃度較低，使得泡沫形成量增幅緩慢。隨后，油茶籽蛋白起泡性及泡沫穩定性隨著pH的增加而增加，可能是不溶性蛋白質顆粒由于靜電作用吸附于氣-液界面增加了蛋白質膜的黏性，并且隨著pH遠離等電點，蛋白質受到分子間的斥力增大，溶解性增加，許多基團暴露出來，蛋白質迅速擴散到氣-液界面，降低氣泡界面張力[10]，從而提高了泡沫穩定性。蒸汽爆破改變了蛋白質的結構，暴露了更多的基團，防止蛋白質在油-水界面展開，從而提高油茶籽蛋白的起泡性和泡沫穩定性[9]。

2.3.2.2 蛋白質量濃度的影響(見圖7)

由圖7可知，經汽爆處理的油茶籽蛋白起泡性和泡沫穩定性均隨著蛋白質量濃度的增大而增大，且大于未汽爆處理的。這可能是因為蛋白質量濃度越高，更多的氣泡可能被捕獲在蛋白質所形成的柔性界面膜內，越有利于形成穩定的氣泡，所形成的蛋白質粘附性也越好，因而有利于提高蛋白質的起泡性和泡沫穩定性[11]。此結果與文獻[12]的結果一致。蛋白質量濃度影響起泡性的另一原因可能是所形成的蛋白質氣泡與液相相溶之后，迅速吸附到氣-液界面發生重排形成穩定薄膜[13]，從而提高油茶籽蛋白起泡性和泡沫穩定性。

圖7 蛋白質量濃度對起泡性與泡沫穩定性的影響

2.3.2.3 NaCl濃度的影響(見圖8)

圖8 NaCl濃度對起泡性與泡沫穩定性的影響

由圖8可知，汽爆處理與未汽爆處理的油茶籽蛋白起泡性均隨著NaCl濃度的增加而減小，泡沫穩定性則呈現先上升后下降的趨勢，但經汽爆處理的油茶籽蛋白起泡性和泡沫穩定性均大于未汽爆處理的。適當的鹽濃度可以產生鹽溶作用，但當溶液中離子強度過高時會發生鹽析作用，并且高離子強度會對蛋白質產生靜電屏蔽作用，使得蛋白質之間靜電電荷排斥減小，并導致不溶性聚集體形成，使蛋白質溶解度降低[14]，最終導致油茶籽蛋白起泡性和泡沫穩定性降低。

2.3.2.4 蔗糖濃度的影響(見圖9)

由圖9可知，相對于未汽爆處理的油茶籽蛋白，汽爆處理的油茶籽蛋白起泡性和泡沫穩定性均較高。油茶籽蛋白起泡性隨著蔗糖濃度的增加而增大，可能是因為蔗糖的加入使得溶液體系黏度增加，提高了蛋白質的起泡性[15]。油茶籽蛋白泡沫穩定性則呈現先上升后下降的趨勢，可能是因為蔗糖濃度較低時，隨著蔗糖濃度增加溶液黏度增大，使水與汽泡更難分離，氣-液界面膜穩定性增加，產生的泡沫不易消除，因此蛋白質泡沫穩定性增加[16]；當蔗糖濃度超過一定范圍時，溶液體系黏度太大，蛋白質分子在氣-液界面難以展開，使氣-液界面膜體積減少，抑制了泡沫的膨脹，從而泡沫穩定性下降。

2.3.3 乳化性與乳化穩定性

2.3.3.1 pH的影響(見圖10)

圖10 pH對油茶籽蛋白乳化性與乳化穩定性的影響

由圖10可知，未汽爆處理與汽爆處理的油茶籽蛋白乳化性和乳化穩定性均呈現先下降后上升的趨勢。當pH為4時，接近油茶籽蛋白等電點，蛋白質所帶凈電荷較少，分子間作用力較小，蛋白質親水性降低，從而使油-水界面的蛋白質減少，乳化性和乳化穩定性都最低。隨著pH繼續增大，較大的pH使得埋藏在蛋白質分子內的官能團暴露出來，并且油-蛋白質界面和水-蛋白質界面影響了油-水界面的作用，使蛋白質溶解度增加，參與乳化作用的蛋白質含量增加，使得乳化性和乳化穩定性提高[17]。汽爆處理油茶籽蛋白乳化性和乳化穩定性均高于未汽爆處理的，可能是因為蒸汽爆破屬于瞬時高溫高壓過程，蛋白質發生變性，導致蛋白結構發生改變，更多的疏水基團和親脂基團暴露，使其乳化性發生改變[9]。

2.3.3.2 蛋白質量濃度的影響(見圖11)

圖11 蛋白質量濃度對乳化性與乳化穩定性的影響

由圖11可知，隨著蛋白質量濃度的增加，油茶籽蛋白乳化性快速升高，可能是隨著蛋白質量濃度的增加，蛋白質向油-水界面擴散能力增強，蛋白質表面覆蓋率提高，形成更多的乳狀液，因此乳化性增加[18]。當蛋白質量濃度低于3 g/100 mL時，乳化穩定性隨著蛋白質量濃度的增加迅速增加；當蛋白質量濃度大于3 g/100 mL時，乳化穩定性下降。高蛋白質量濃度的乳液相對穩定，液滴之間的空間和靜電排斥力增強而防止蛋白質聚集，可以有效地防止增加的界面蛋白質液滴之間的絮凝，提高乳化穩定性。但當蛋白質量濃度高到一定程度時，活化能增加，可以阻止蛋白質遷移，降低蛋白質的有效吸附性，從而使蛋白質的乳化穩定性下降[18]。

2.3.3.3 NaCl濃度的影響(見圖12)

圖12 NaCl濃度對乳化性與乳化穩定性的影響

由圖12可知，NaCl 的添加使油茶籽蛋白乳化性和乳化穩定性先升高后下降，當NaCl濃度為0.2 mol/L時，乳化性最高，NaCl濃度為0.1 mol/L時，乳化穩定性最高。NaCl濃度較低時，蛋白質的展開度增加，提高了蛋白質溶解度，油-水界面的蛋白質濃度增加，發生了鹽溶效應。隨著NaCl濃度的繼續增加，乳化性和乳化穩定性下降，原因可能是NaCl濃度增大，蛋白質表面電荷減少[19]，蛋白質之間靜電斥力減小，降低油-水界面的穩定性，使蛋白質乳化性和乳化穩定性降低。因此，一定濃度的NaCl有助于提高油茶籽蛋白的乳化性和乳化穩定性。

2.3.3.4 蔗糖濃度的影響(見圖13)

圖13 蔗糖濃度對乳化性與乳化穩定性的影響

由圖13可知，隨著蔗糖濃度增大，油茶籽蛋白乳化性和乳化穩定性均呈上升的趨勢，并且汽爆處理的油茶籽蛋白乳化性和乳化穩定性大于未汽爆處理的。其原因可能是蔗糖的添加使得水相介質流變性改變，乳化體系黏度增加，穩定性增強，并且蔗糖可以阻礙蛋白質的聚集、鞏固膠束結構，有利于蛋白質的乳化，且蔗糖可以在油-水界面形成膜，膜的穩定性是影響乳化性和乳化穩定性的主要原因[20]。因此，蔗糖的添加能夠改善油茶籽蛋白的乳化性和乳化穩定性。

3 結 論

蒸汽爆破結合堿溶酸沉法可以提高油茶籽蛋白提取率，經蒸汽爆破處理(壓力0.8～2.3 MPa，時間30～120 s)后最佳堿溶酸沉提取條件為料液比1∶10、提取溫度40℃、pH 10、提取時間50 min。在最佳條件下，油茶籽蛋白提取率為71.01%，比未蒸汽爆破處理的提高了12.27個百分點，且蛋白質產品的功能性質得到提高。pH、蛋白質量濃度、NaCl濃度均對油茶籽蛋白的起泡性和泡沫穩定性、乳化性和乳化穩定性有不同程度的影響；蔗糖濃度對油茶籽蛋白起泡性作用較明顯，但對泡沫穩定性無改善作用，其對蛋白質的乳化性與乳化穩定性起改善作用。蒸汽爆破具有低耗、無污染、工作效率高、提取效率高以及提高物料功能性質等優點。因此，通過本研究可以對油茶籽蛋白在食品中的進一步應用具有一定的指導意義。