豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP4蛋白B細胞表位的初步篩選

王愛萍，陳 冰，劉紅亮，周景明，陳玉梅，劉燕凱，祁艷華，張改平

(鄭州大學 生命科學學院，鄭州 450000)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一類嚴重危害養豬業的高度接觸性傳染病[1]。PRRSV是單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目 (Nidovirales)，動脈炎病毒科 (Arterividae)[2]。PRRSV分為兩種基因型：歐洲型(基因Ⅰ型)和北美洲型(基因Ⅱ型)[3]。

PRRSV的基因組大小約15kb，包含至少12個開放閱讀框 (Open reading frames,ORFs)，分別編碼不同的病毒蛋白[4]。由ORF4編碼的GP4蛋白參與病毒的轉運，在病毒復制中起重要作用[5]。GP4與GP2a、GP2b、GP3可形成異源多聚體，在病毒感染中發揮關鍵作用[6-7]。有研究報道，GP4與GP2、GP3和GP5相互作用，與CD163受體相識別，介導PRRSV侵染宿主細胞[8]。

PRRSV感染機體后，引發體液免疫應答，從而產生多種特異性抗體，有助于避免機體再次感染。有研究證明，中和抗體在抗PRRSV感染中起重要作用[9-10]，相關中和表位已有報道。本研究通過合成PRRSV GP4蛋白的重疊多肽，經多肽ELISA篩選GP4蛋白的B細胞表位，旨在深入了解和研究GP4蛋白的B細胞表位，為PRRSV的抗體檢測及其表位疫苗的研究提供 幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗動物血清

PRRSV陰性血清及JXA1-R毒株免疫的PRRSV陽性血清由鄭州大學生命科學學院動物分子免疫實驗室保存。

1.2 GP4重疊多肽的設計

根據GenBank數據庫中發表的PRRSV GP4蛋白序列(GenBank:ACN 93856.1)，設計合成17條重疊多肽，每條多肽長18個氨基酸，相鄰肽段重疊9個氨基酸殘基。覆蓋了除去N端信號肽序列(前22個氨基酸)的完整的GP4蛋白，送由上海吉爾生化有限公司進行合成，將重疊多肽分別命名為GP4-1～GP4-17。

1.3 間接ELISA

將1 mg多肽干粉溶于50 μL 二甲基亞砜(DMSO)中，每管5 μL分裝，凍存于-80 ℃ 冰箱。

用碳酸鹽緩沖溶液(CBS)將多肽稀釋至10 ng/μL，每孔100 μL作為包被抗原，設立3個平行對照，PRRSV N蛋白作為陽性對照。在用50 g/L脫脂奶進行封閉后，將PRRSV陰性血清和陽性血清按照1∶100的比例稀釋作為一抗，HRP標記的羊抗豬IgG(Goat anti-Swine IgG/HRP)以 1∶5 000的比例稀釋作為二抗，最后避光顯色 5 min后終止，測定OD450 nm值。

1.4 Dot-ELISA

將條狀硝酸纖維素膜(NC膜)在磷酸鹽緩沖液(PBS)中完全浸濕，室溫風干。將多肽用PBS稀釋至2 μg/μL，取1 μL點在膜上，干燥，PRRSV N蛋白作為陽性對照。用50 g/L脫脂奶封閉2 h后，以1∶100稀釋的PRRSV陰性血清和PRRSV陽性血清為一抗，二抗是以 1∶5 000的比例稀釋后的HRP標記的羊抗豬IgG，最后化學發光法顯示試驗結果。

1.5 抗免疫顯性肽段抗體水平的測定

將篩選得到的免疫顯性多肽用CBS稀釋至10 ng/μL，100μL/孔作為包被抗原，設立3個平行對照，并以不相關多肽作為陰性對照。封閉液為50 g/L脫脂奶，試驗豬免疫前的陰性血清和免疫后每周采血分離得到的陽性血清以1∶100的比例稀釋作為一抗，1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG作為二抗，最后避光顯色5 min，終止后測定OD450 nm值。

2 結果與分析

2.1 GP4蛋白重疊多肽的合成

最終成功合成13條重疊多肽(表1)，GP4-11、GP4-12、GP4-16、GP4-17號重疊多肽未成功合成。合成的多肽純度均能達到95%以上，滿足后續的試驗要求。

表1 重疊多肽的合成Table 1 Synthesis of overlapping peptides

2.2 ELISA篩選GP4蛋白免疫顯性肽段

以13條重疊多肽作為包被抗原，通過間接ELISA的方法對多肽與血清間的反應進行測定，ELISA結果如圖1所示。圖1中GP4-1、GP4-2、GP4-4和GP4-5號肽段與陽性血清產生反應，將具有陽性反應的結果匯總為圖2，以便觀察并分析結果。從圖2可知，GP4-1號肽與9411、9437號試驗豬的血清有較弱的陽性反應；GP4-2號肽與9400、9411、9427、9464號試驗豬的血清有較弱的陽性反應；GP4-4號肽與5頭試驗豬的血清均有較強的陽性反應；GP4-5號肽與5頭試驗豬的血清均有較弱的陽性反應，其余肽段與陽性血清樣品均沒有反應。

圖1中A、B、C、D、E圖分別對應編號為9400、9411、9427、9437、9464試驗豬的試驗結果?？v坐標為OD450nm值，橫坐標為多肽編號，PC為陽性對照(PRRSV N蛋白)。淺色矩形代表免疫前，深色矩形代表免疫后12周。

圖2中A、B、C、D分別代表GP4-1、GP4-2、GP4-4、GP4-5號肽段與5頭試驗豬PRRSV陰性和陽性血清的反應結果，縱坐標為OD450nm值，橫坐標為試驗豬編號，淺色矩形代表免疫前，深色矩形代表免疫后12周。

2.3 Dot-ELISA方法篩選GP4蛋白免疫顯性肽段

以13條重疊多肽作為抗原，通過Dot-ELISA的方法進行篩選，結果如圖3所示。GP4-4號肽段與5頭試驗豬的血清樣品均有明顯的陽性反應；GP4-1號肽與9437號豬的陽性血清有較弱的陽性反應；GP4-2號肽與9400號豬的陽性血清有較弱的陽性反應；其余多肽與5頭試驗豬的血清樣品均沒有陽性反應。Dot-ELISA與間接ELISA的結果基本一致，篩選出1個GP4蛋白B細胞免疫顯性肽段GP4-4：Ⅰ(50) SCLRHGDSSSPTIRKSS (67)。

圖3中，GP4-1～15為肽段編號，N代表PRRSV N蛋白，9400、9411、9427、9437、9464為試驗豬編號，PC代表免疫后12周的結果，NC代表免疫前的結果。

2.4 抗GP4-4號肽段的抗體水平

以篩選出來的免疫顯性多肽GP4-4作為包被抗原，測定其抗體水平，結果如圖4所示。抗GP4-4號肽段的抗體可在免疫后3～5周被檢測到，之后呈現為較均勻的穩步上升。

圖4中，9400、9411、9427、9437、9464為試驗豬編號?？v坐標為OD450nm值，橫坐標為免疫周數，NC為陰性對照(不相關多肽)。

A、B、C、D、E分別對應編號為9400、9411、9427、9437、9464參試豬的試驗結果 A,B,C,D,and E correspond to the experimental results of pigs numbered 9400,9411,9427,9437,and 9464,respectively

圖1 ELISA方法篩選PRRSV GP4蛋白免疫顯性肽段
Fig.1 Screening immunodominant peptides of PRRSV GP4 protein by ELISA method

A、B、C、D分別代表GP4-1、GP4-2、GP4-4、GP4-5號肽段與5頭參試豬PRRSV陰性和陽性血清的反應結果 A,B,C,and D represent the results of the reaction of the GP4-1,GP4-2,GP4-4,and GP4-5 peptides with the PRRSV-negative serum and the positive serum of the five experimental pigs,respectively

圖2 ELISA方法篩選PRRSV GP4蛋白免疫顯性肽段
Fig.2 Screen immunodominant peptides of PRRSV GP4 protein by ELISA method

圖3 Dot-ELISA方法篩選PRRSV GP4蛋白免疫顯性肽段Fig.3 Screening immunodominant peptides of PRRSV GP4 protein by Dot-ELISA method

圖4 ELISA方法檢測針對GP4-4號多肽的抗體的消長規律Fig.4 The growth and decline of antibodies against GP4-4 polypeptide detected by ELISA method

3 討 論

本研究在設計GP4蛋白的重疊多肽時，考慮到信號肽的主要功能是幫助蛋白跨膜定位，因此將GP4蛋白的信號肽區域截取掉，只對23～178 位氨基酸進行多肽設計與合成。另外，已知B細胞表位的大小一般為5～15個氨基酸殘基，為盡量避免表位篩選遺漏，本試驗在設計重疊多肽時，將每段多肽的殘基數定為18個，相鄰肽段重疊9個氨基酸殘基。

本研究通過合成PRRSV GP4蛋白的重疊多肽，經多肽ELISA對PRRSV JXA1-R毒株GP4蛋白的重疊多肽進行篩選，結果顯示GP4-4號肽段與所有試驗豬陽性血清均有較強陽性反應；GP4-1、GP4-2號肽段并不是與所有的試驗豬陽性血清都產生反應，且反應較弱，存在個體差異；另外，GP4-5號肽段與所有試驗豬陽性血清均有較弱的陽性反應，這可能是由于GP4-5號肽段與GP4-4號肽段存在9個氨基酸殘基重疊的原因。Dot-ELISA結果也顯示GP4-4號肽段與所有試驗豬陽性血清均有較強陽性反應，與間接ELISA的結果一致。初步篩選得到的GP4-4號肽段(50～67 aa)與Meulenberg等[11]和De Lima等[12]篩選的B細胞表位存在較大的重疊區域，驗證了前人結果的同時也說明該肽段為優勢肽段。GP4-4號肽段(50～67 aa)還包含中和表位核心區域51～65 aa或59～67 aa[11-13]，具有很大的研究價值。

在本研究中，抗GP4-4號肽段的抗體可在免疫后3～5周被檢測到，該肽段包含中和表位，并且已知針對PRRSV GP4蛋白的中和抗體可在豬感染PRRSV后20 d左右時被檢測到[14]，本研究的結果與已有報道基本一致。研究表明，中和抗體在抗PRRSV感染中起關鍵作用[9-10]。血清中的中和抗體可以保護高危易感群體，包括懷孕母豬和仔豬。因此，在對豬進行PRRSV疫苗免疫后，可檢測機體內是否產生針對GP4蛋白B細胞中和表位的抗體，來判斷機體是否產生中和抗體，從而評估疫苗是否對機體產生了保護作用。

總之，對PRRSV GP4蛋白B細胞表位的研究不僅能夠用于PRRSV的抗體檢測，還對PRRSV表位疫苗的研究有所幫助，表位疫苗則是未來疫苗的發展方向。