陸地棉 GhRab7基因鑒定及酵母中鹽脅迫響應分析

劉凌云，李玉龍，王艷霞，李秀文，張 彤

(河南大學 生命科學學院，河南開封 475004)

Rab蛋白是一類分子質量為20～30ku、在真核生物中廣泛存在的GTP結合蛋白，該類蛋白不僅通過調節囊泡的形成、運輸和錨定等行為參與胞內膜系統融合過程，而且也作為信號分子參與調節各種生長發育及脅迫響應過程[1-3]。在這些Rab蛋白中，Rab7(RabG)相關蛋白負責調節內吞物質轉運到溶酶體降解的過程[4]。

值得注意的是，已經發現一些Rab7基因對干旱、鹽、低溫、脫落酸(ABA)、病菌等環境刺激發生響應。干旱和ABA強烈上調水稻OsRab7的轉錄，鹽脅迫時超表達OsRab7的轉基因水稻根尖液泡數量增多，脯氨酸含量增加[5]。水楊酸及病原菌均能誘導擬南芥AtRab7(RabG3e)的表達，超表達AtRab7轉基因擬南芥內吞過程加快，鹽和滲透脅迫耐性增加，活性氧積累減少[6]。狼尾草PgRab7轉錄明顯受鹽、冷、干旱及IAA的誘導，超表達PgRab7的轉基因煙草隨著堿性磷酸酶活性增加，其對鹽和甘露醇的抗性也增加[7]。此外，干旱、鹽及ABA分別調節獐毛屬AeluropuslagopoidesAlRab7的表達，異源表達AlRab7的大腸桿菌在分別含有鹽、甘露醇、ABA及IAA的培養上生長更好[8]。這些研究結果暗示Rab7基因在植物中參與逆境脅迫尤其是鹽脅迫響應的功能可能是保守的。

土壤鹽分(NaCl)過度積累嚴重威脅作物的產量[9]，鹽脅迫影響植物種子萌發、營養及生殖生長等過程。棉花(GossypiumhirsutumL.)屬于中度耐鹽作物，但種植地土壤的鹽堿化嚴重影響其產量和品質。2015年陸地棉參考基因組序列的發表，使通過棉花功能基因的研究改良棉花種質以適應嚴苛的環境條件變得更加高效和方便[10]。轉錄組學研究剖析了棉花參與鹽脅迫響應的各種組分[11]。此外，發現棉花GhZFP1(zinc finger protein1)轉基因煙草鹽脅迫耐性增強[12]；擬南芥中超表達棉花GhCIPK6(calcineurin B-like(CBL)-interacting protein kinase6)也表現出耐鹽和耐旱特征[13]，但棉花耐鹽的詳細機制依然不清楚。本研究從陸地棉基因組中鑒定到一個Rab7類基因，命名為GhRab7。結果表明，GhRab7編碼207個氨基酸組成的一個小G蛋白，該蛋白具有典型的Rab類蛋白保守基序。酵母中異源表達GhRab7基因，表現出不耐鹽脅迫的特征；結合GhRab7啟動子序列含有多個鹽脅迫響應元件的結果分析，認為GhRab7可能在陸地棉應對土壤鹽脅迫響應過程中發揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養

將紗布包裹的陸地棉(Gossypiumhirsutumacc. TM-1)種子浸濕后放入培養皿中，置于 25 ℃培養箱催芽。萌發后的幼苗移植于土壤：蛭石體積比為1∶1的培養缽內，在16 h光/8 h暗， 26 ℃白天/20 ℃晚上的條件下長至第二片真葉出現。取真葉用錫箔紙包裹，液氮速凍備用。

1.2 陸地棉 GhRab7基因的鑒定和分析

從棉花功能基因組數據庫(https://cottonfgd.org/)中搜索并下載Rab7相關基因，通過ExPASy在線程序(http://web.expasy.org/)對相應基因編碼蛋白的分子質量進行預測；分別用MEGA X和DNAMAN軟件進行系統進化樹構建(鄰接法，Bootstrap重復次數設定為1 000)和氨基酸序列保守性及同源性分析；選取GhRab7基因起始密碼子ATG上游2 000 bp序列通過PLACE網站(https://sogo.dna.affrc.go.jp/)進行植物鹽脅迫響應順式作用元件預測與分析。

1.3 GhRab7-pYES2表達載體的構建

利用TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取陸地棉幼苗真葉總RNA，用M-MLV反轉錄試劑盒(Promega公司)反轉錄成cDNA。PCR擴增出624 bp的Gh_A13G0304(GhRab7)CDS序列，通過TA克隆連入pGEM-T載體(Promega公司)中，測序正確后，采用KpnI和XbaI(Takara公司)雙酶切方法將GhRab7編碼序列重組入酵母表達載體pYES2。PCR擴增所用引物(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)為5′-CCCGGTACCATGCCATCTCGCCGTAGAAC-3′和 5′-GGGTCTAGATCAACAGTCACATCCAGTTG-3′。

1.4 酵母轉化及鹽脅迫分析

通過醋酸鋰方法[14]分別將pYES2空載體和GhRab7-pYES2重組載體轉化入INVSC1酵母細胞并用缺乏尿嘧啶的SC培養基(SC-U培養基，購自北京泛基諾生物公司)篩選陽性克隆。然后將不同酵母株系陽性克隆在含有w=2%乳糖(購自上海生工生物工程技術服務有限公司)的SC-U培養基中震蕩培養12 h，菌液OD600調整至1.0，按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000、 1∶10 000的體積比稀釋后取1 μL點到NaCl(200 mmol/L或300 mmol/L)+YPD培養基(20 g/L葡萄糖，20 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，20 g/L瓊脂粉)上，將該培養基置于30 ℃培養箱培養，2 d后觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 陸地棉 GhRab7基因及蛋白的分子特性

為了解棉花Rab7基因的功能，以Rab7為關鍵詞在陸地棉全基因組數據庫(cottonFGD，陸地棉，南京農業大學組裝及基因注釋)中檢索到24個標記為Ras相關蛋白Rab7的候選基因(表1)，除了將5個CDS長度僅有225～576個核苷酸，編碼的氨基酸數低于200個的基因(Gh_A12G0832、Gh_D05G2587、Gh_D09G0431、Gh_D11G2824和Gh_Sca060638G01)在后續分析中予以舍棄外，余下19個潛在的Rab7基因CDS長度為615～702個核苷酸，編碼氨基酸個數在204～233內，預測的蛋白質理論分子質量也在22.76～26.25 ku，符合Rab蛋白的典型特征[15]。陸地棉是異源四倍體，其基因組分別來源于二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉。進一步的分析也發現，這19個潛在的Rab7基因在陸地棉A基因組(10個)和D基因組(9個)分布不同，分別分布于2、3、5、9、10、12和13號染色體，暗示Rab7成員在陸地棉基因組進化過程中存在差異分化。

2.2 陸地棉GhRab7蛋白系統進化分析

為了解陸地棉Rab7蛋白的系統進化關系，對19個潛在的棉花Rab7蛋白與雙子葉植物擬南芥AtRab7、單子葉植物水稻OsRab7一起進行了系統進化樹的構建。結果顯示，除個別蛋白外，大部分A基因組上編碼Rab7蛋白的棉花候選基因可聚類到D基因組相應的位置，如A基因組9號染色體Gh_A09G0788與D基因組上9號染色體Gh_D09G0791聚為一類(圖1)，由于陸地棉四倍體是由二倍體A和D基因組進化來的，因此這些結果進一步說明陸地棉可能同時具有A與D兩套基因，同時不排除Rab7基因在進化過程中只保留一組二倍體基因的可能[16]。陸地棉Gh_A13G0304和Gh_D13G0342與擬南芥和水稻Rab7蛋白在系統進化樹上位于同一個分支上，因此從進化關系來看，棉花這2個蛋白與擬南芥和水稻相應蛋白的親緣關系都非常近，暗示它們在植物中可能具有類似的功能。

表1 陸地棉 GhRab7基因的分子特性Table 1 Molecular characterization of GhRab7 genes in upland cotton

圖1 陸地棉GhRab7蛋白的系統進化分析Fig.1 Identification and phylogenetic analysis of Rab7 gene family in upland cotton

為進一步分析棉花與擬南芥、水稻Rab7蛋白間的關系，利用DNAMAN軟件對這些基因編碼的氨基酸序列進行了同源關系分析。結果顯示，棉花同一個Rab7蛋白與擬南芥、水稻Rab7蛋白氨基酸序列同源性均非常相近，但不同棉花候選Rab7蛋白與擬南芥和水稻同源性為50.4%～76.8%，說明這些候選Rab7蛋白在進化過程中發生了分歧，在功能上可能會有所差異；同時也注意到，棉花Gh_A13G0304編碼的蛋白與水稻和擬南芥一致性最高，分別達到76.8%和72%(圖2)。這些結果均暗示Gh_A13G0304可能是要尋找的棉花Rab7基因，將其命名為GhRab7。

黑色框代表棉花中與擬南芥和水稻Rab7同源性最高的蛋白 Black box represents that upland cotton Gh_A13G0304 shares the highest amino acid sequence identity withArabidopisisand rice

圖2 陸地棉與擬南芥、水稻Rab7蛋白同源性分析
Fig.2 The identify of Rab7 in upland cotton,Aradopsisand rice

2.3 陸地棉 GhRab7生理生化功能的預測

為探索棉花GhRab7可能的功能，首先對該基因編碼蛋白進行序列保守性分析。通過與已知功能的擬南芥AtRab7和水稻OsRab7序列比對發現，棉花GhRab7含有5個典型的保守基序(G1-G5)(圖3)，其中G1、G3、G4和G5是鳥苷酸結合區，涉及核苷酸的結合和水解過程；G1是磷酸及Mg2+結合位點，G2則是效應器結合區，G4和G5是GTP/GDP結合和水解的關鍵序列，該序列保守氨基酸突變會導致Rab蛋白組成型激活或失活[17]。而且，棉花GhRab7蛋白C-末端含有保守的Cys殘基(圖3)，該Cys殘基與Rab蛋白的囊泡附著及蛋白功能密切相關[18]。這些結果暗示棉花GhRab7在生化上可能具有結合并水解GTP，參與囊泡轉運及融合的功能。

“*”代表Rab7蛋白C-未端保守的Sys殘基 “*” indicates a conserved Cys residue at the C-terminus of Rab 7 protein

圖3 陸地棉與其他物種Rab7氨基酸序列保守性分析
Fig.3 Conserved motifs and their sequences in Rab7 proteins

鑒于多種Rab7基因參與了植物對鹽脅迫的響應，選取GhRab7基因ATG上游2 000 bp序列，利用PLACE網站進行鹽脅迫響應元件的分析。結果發現，GhRab7基因上游含有3種典型的鹽脅迫響應元件：4個GT1GMSCAM4、4個DRECRTCOREAT和3個DRE2COREZMRA-B17順式作用元件(表2)。此外，Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)在線預測GhRab7蛋白亞細胞定位結果顯示，該蛋白定位于液泡內。說明在植物遭受鹽脅迫時該蛋白可能通過介導囊泡轉運將過多的Na+貯存于液泡來躲避鹽毒害。

表2 陸地棉 GhRab7啟動子序列鹽脅迫響應元件分析Table 2 The cis-acting elements in responsive to salt stresses in GhRab7 promoter

2.4 酵母異源表達 GhRab7的鹽響應分析

為證實棉花GhRab7基因響應鹽脅迫的生理功能，構建了GhRab7-pYES2重組載體，并將其轉入酵母細胞，在不同濃度NaCl處理下進行異源表達。如圖4所示，在添加150 mmol/L NaCl的YPD培養基上，轉pYES2空載的酵母細胞在稀釋至10-4時依然能夠生長，但轉GhRab7基因的酵母細胞在稀釋至10-1時生長已經明顯受到抑制；同樣，在300 mmol/L NaCl的YPD培養基上，轉GhRab7基因的酵母細胞表現出相似的特征。這些結果表明GhRab7參與了鹽脅迫響應過程。

圖4 異源表達 GhRab7基因酵母細胞鹽響應分析Fig.4 Effect of GhRab7 expression in yeast under salt stresses

3 討 論

土壤鹽害擾亂植物細胞內離子平衡、降低代謝活性，進而嚴重影響作物產量。植物通過調節生長和脅迫耐受性來適應或者避免不利的環境條件。棉花是世界范圍內重要的經濟作物。作為甜土植物，棉花比其他主要作物更耐受鹽脅迫[19]。然而，種植區土壤鹽堿化依然限制了棉花產量。已經知道鹽脅迫誘導棉花GhSOS1基因的表達，擬南芥超表達GhSOS1轉基因植株通過維持低水平Na+/K+和調節細胞內鹽脅迫響應基因的表達而長勢更好[20]；擬南芥超表達棉花GhTOM(G蛋白偶聯受體)、GhWRKY34(轉錄因子)和GhPLATZ1(鋅指類轉錄因子)也表現出更耐鹽表型[21-23]。棉花鹽脅迫響應基因的研究有助于優化栽培種質，提高棉纖維產量。

植物Rab蛋白參與花粉管生長[24]，葉片形態[25]，自噬[26]及抗病反應[25]等過程的調節。到目前為止，在酵母、哺乳動物和擬南芥中Rab相關成員調節質膜運輸研究的比較清楚，然而棉花中Rab蛋白功能還沒有很好的研究。此外，雖然Rab基因的保守性較高，但不同物種Rab基因個數和基因結構差異比較大[8]，不同植物Rab基因的研究將為Rab功能挖掘和應用到生產奠定 基礎。

本研究從陸地棉中鑒定了一個Rab相關基因GhRab7；該基因編碼蛋白含有5個保守的G區基序，這些基序在蛋白質三級結構上聚集形成一個鳥苷酸結合及水解功能域，該功能域與Rab活性密切相關；同時，該蛋白C末端保守Cys殘基是Rab翻譯后異戊烯化修飾位點，該位點修飾情況決定Rab與膜系統的結合，進而影響胞內囊泡融合過程[26]。

真核細胞主要通過膜上蛋白識別和感知外部環境信號，這些膜上蛋白包括能夠引起細胞對外界環境信號響應的受體和感受子。已知擬南芥和水稻Rab7作為小G蛋白信號分子感知及響應外界環境鹽脅迫[6,27]；轉錄因子通過識別順式作用元件來響應各種環境信號；GhRab7基因上游含有多個鹽脅迫響應順式作用元件，暗示該基因可能通過轉錄因子與這些順式作用元件結合來響應鹽脅迫，這還需要更多的試驗來證實。此外，酵母異源表達GhRab7也顯示出不耐鹽的特征。這些結果說明，棉花GhRab7可能具有響應非生物脅迫的能力。

本研究從棉花中克隆了GhRab7基因，該基因編碼一個Rab類小G蛋白，推測其可能通過調節囊泡運輸而介導脅迫響應過程。本研究結果為進一步明晰Rab類蛋白的生物學功能及脅迫響應調控機制奠定了基礎。