‘蜜脆’蘋果果皮和果肉香氣差異

李 瑞，劉翠華，石金瑞，閆 丹，張 琪，劉瀟然，任小林

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

果實品質由色澤、香氣、質地、果形以及是否有病蟲害等因素決定；其中果實香氣能夠使人放松，心情愉悅，解除人的身心疲勞與緊張，刺激食欲，是吸引消費者的重要品質之一[1]。國內外關于蘋果香氣的研究已經有50余年歷史，期間有300多種香氣物質被鑒定，主要為醇、醛、酯、酮、醚、萜類以及芳香族類化合物[2]。蘋果的品種、成熟度、環境、栽培管理條件以及采后貯藏條件等均可影響果實香氣的形成[3-4]，研究果實的香氣對于提高果實品質，增加商品價值有重要的意義。

‘蜜脆’(Honeycrisp)蘋果是由美國明尼蘇達大學于1991年培育而成的中熟蘋果新品種，因其果肉細脆、香味怡人而被廣大消費者喜愛[5]，目前關于‘蜜脆’的研究主要集中于栽培管理、病蟲害以及采后貯藏等方面，而對果實香氣品質的研究較少[4-8]。香氣組成和含量在同一果實的不同部位存在組織差異；如‘富士’蘋果香氣物質以2-甲基丁醇、順-3-己烯醇、反-2-己烯醛以及2-甲基丁酸乙酯為主，其中順-3-己烯醇和反-2-己烯醛在果皮中的含量顯著高于果肉中的含量，但2-甲基丁酸乙酯在果皮和果肉中含量相當[9]。本研究利用有機溶劑(甲基叔丁基醚)萃取果皮和果肉中的香氣物質，采用氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)，并基于標準物質進行定性定量，從而揭示‘蜜脆’果實果皮和果肉中香氣成分的組成和差異，旨在為‘蜜脆’蘋果品質評價以及研究蘋果香氣物質合成提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘蜜脆’果實于2016年9月15日采自寶雞一果樹生長狀況良好的果園。果實采收后立即運往實驗室，選擇大小、色澤一致，無病蟲害、無機械損傷的果實15 個，每5 個為一組；用削皮器削取果皮，厚度小于0.2 mm，液氮速凍，存于-80 ℃冰箱，用于果皮香氣物質的分析；果肉用于果肉香氣物質的分析，重復3 次。

1.2 標準品與試劑

內標3-壬酮(3-nonanone)購于Alfa Aesar公司(天津，中國)；用于測定保留指數(Retention Index,RI)的C7-C30飽和系列烷烴購于Supelco公司(羅夕法尼亞，美國)；用于提取揮發性物質的MTBE(HPLC級)購于Tedia公司(費爾菲爾德，美國)。揮發性標準物質的來源以及定量離子(Quantifying Ions，QI)、校正因子(Correction Factors，CF)見表1。

此外，以下揮發性標準物質也用于揮發性物質的定量，但是在本試驗中并未檢測到相應的成分，其中2-丁醇和乙酸芐酯購于Alfa Aesar公司(天津，中國)；2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、2-戊醇和(E,E)-2,4-壬二烯醛購于Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美國)。

表1 香氣物質GC-MS分析所用的標準物質Table 1 Authentic standard of aroma compounds used in GC-MS analysis

注：a來源.Sigma，Sigma-Aldrich 公司(圣路易斯，美國)； Alfa，Alfa Aesar公司(天津，中國)；Amatek，蘇州愛瑪特有限公司(蘇州，中國)； b.保留指數.香氣物質在VF-WAXms毛細管柱上的實測保留指數；c定量離子.在SIM模式下定量離子的質荷比；d響應因子.目標物質與相應內標的校正因子；-.未計算。

Note:a Source.Sigma.Sigma-Aldrich Co.Ltd.(St.Louis,MO,USA); Alfa,Alfa Aesar Co.Ltd.(Tianjin，China); Amatek,Amatek Scientific Co.Ltd.(Suzhou,China); b RI.actual retention index on VF-WAXms Column; c QI.the quantify ion of quantification ion under SIM mode; d IF.the correction factors for each compound vs.the corresponding internal standard; -.un-calculated.

1.3 方法

1.3.1 香氣物質的提取 香氣物質提取方法參考石金瑞等[10]并改進。將-80 ℃凍存的果實樣品在液氮中進行研磨，使其成均勻的粉末狀，稱取2 g樣品于10 mL的離心管內；并加入3 mL的蒸餾水，渦旋混勻；再加入3 mL的MTBE提取液和10 μL內標[V(3-壬酮)∶V(甲醇)=5∶ 30 000]，震蕩搖勻后于超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)超聲萃取(25 ℃)30 min；之后用D-37520型離心機(美國Thermo Fisher公司)離心(11 200 r/min，4 ℃)15 min；取上清液 2 000 μL，利用干式氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)濃縮至500 μL，過濾后，取1 μL進行GC-MS分析。

1.3.2 果實香氣物質的GC-MS分析 使用美國Thermo Fisher ISQ GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀進行香氣組分的分析。色譜條件：色譜柱為VF-WAXms柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm彈性石英毛細管柱；進樣口溫度為230 ℃，不分流進樣；升溫程序為初溫40 ℃保持3 min，后以 5 ℃/min升至150 ℃，再以8 ℃/min升至 220 ℃，保持10 min；載氣為高純度的氦氣 (99.999%)，流速為1 mL/min。質譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度 240 ℃；離子源溫度240 ℃；激活電壓1.5 V；質量掃描范圍是33～380 m/z。

由GC-MS分析得到的原文件，利用Xcalibur(Thermo fisher scientific)與AMDIS (www.amdis.net)軟件進行分析。定性分析：未知化合物的質譜圖同NIST library 質譜庫進行比對，并結合相應標準物質的保留時間與保留指數(Retention index，RI)確定香氣物質，其中VF-WAXms柱上的RI是通過系列飽和鏈狀烷烴(C7-C30)計算而得[11]。定量分析：香氣物質質量分數基于各標準物質的校正因子(CF)計算而得，具體計算過程如下：CF=[(Cs/As)/(Ci/Ai)]，Cx=CF·Ax·Cxi/Axi。其中Cs為標準物質的濃度；As為選擇離子模式下標準物質的面積；Ci為內標3-壬酮的濃度；Ai為3-壬酮的峰面積(QI=113)；Cx為待測物質的濃度；Ax為待測物質在選擇離子模式下的峰面積，Cxi為待測樣品中內標的濃度；Axi為待測樣品中內標的峰面積(QI=113)。無標準物質的香氣物質利用相似物質定量法進行定量[12]，利用相似物質定量的香氣物質見表2。

香氣值(OAV)是指某香氣物質的濃度與該化合物香氣閾值的比值，可通過計算OAV挖掘特征香氣物質[13]。

表2 利用相似物質法定量的香氣物質Table 2 Quantitate aroma compounds based on similar chemicals

注：a定量離子.在SIM模式下定量離子質荷比；b響應因子.目標物質與相應內標的校正因子。

Note:a QI.The quantify ion of quantification ion under SIM mode; b IF.the correction factors for each compound vs.the corresponding internal standard.

2 結果與分析

2.1 ‘蜜脆’果實果皮與果肉香氣組成差異分析

利用氣相色譜-質譜聯用技術定性定量分析‘蜜脆’蘋果果皮與果肉中的香氣物質，共檢測到42種香氣物質，包括酯類、醇類、醛類、酸類、萜烯類和苯環類等6類物質(表3)，各類香氣物質在果實中的分布存在很大差異。

果皮部分共檢測出41種香氣物質(表3)，總質量分數為35 786.10 μg/kg。酯類香氣物質種類最豐富，有21種，質量分數為7 172.20 μg/kg，占果皮香氣物質總量的20.4%(圖1)；醇類香氣物質次之，有9種，質量分數為18 175.29 μg/kg；醛類有4種，以C6醛類物質為主，占醛類香氣物質總量的81.01%；萜烯類2種，分別為α-法呢烯和法尼醇；有機酸3種，含苯環類物質2種。

果肉中共鑒定出34 種香氣物質，其中酯類香氣物質種類最豐富(15種)，質量分數為4 367.56 μg/kg；醇類物質次之(9 種)，但其質量分數最高，為66 294.76 μg/kg，占果肉香氣物質總量的 86.33%(圖1)，以1-丁醇和1,3-辛二醇為主。其次，在果肉中還檢測到醛類物質3種，質量分數為3 889.93 μg/kg，有機酸3種，苯環類物質3種，以及少量的α-法呢烯。

果皮與果肉中檢測到相同的香氣成分有34 種，其中酯類15 種，醇類9 種，醛類3 種，有機酸2 種，含苯環類物質2 種，萜烯類1 種。2 個部位中質量分數較高的香氣成分均為醇類、酯類和醛類，但在同類物質中不同部位的質量分數以及物質組成存在很大差異(圖1)。酯類物質中2-甲-丁酸丁酯、辛酸丁酯、辛酸3-甲基丁酯、辛酸己酯和癸酸丁酯是果皮中特有的酯類香氣物質，支鏈酯類物質2-甲基丁酸乙酯、乙酸2-甲基丁酯和2-甲基丁酸丁酯等在果皮中的質量分數均高于果肉。果皮和果肉中醇類香氣物質質量分數最高且種類相同，但果肉中檢測到的每種醇類物質的質量分數均遠高于果皮(圖1)。‘蜜脆’果實中的醛類物質以C6醛為主，果皮中醛類物質的總量略高于果肉中的總量；其中己醛在果皮中質量分數是3 776.53 μg/kg，在果肉中質量分數是2 228.14 μg/kg，是果肉和果皮中質量分數最高的醛類物質，(E,E)-2,4-葵二烯醛是果皮中特有的醛類物質，質量分數為245.12 μg/kg。萜烯類香氣物質只檢測到2種，分別是α-法呢烯和法呢醇，主要分布在果皮中，質量分數為2 376.04 μg/kg，以α-法呢烯為主，而果肉中只檢測到少量的α-法呢烯，未檢測到法尼醇。除了以上4 類主要的香氣物質外，還檢測到4 種有機酸類物質，3種含苯類物質，二者在果肉、果皮中的質量分數差異不大；有機酸類物質中己酸是果皮中特有的物質，丙酸是果肉中特有的物質；含苯環類物質中苯乙醇是果肉中特有的物質。

表3 ‘蜜脆’果皮、果肉香氣成分及其質量分數Table 3 Aroma compounds and mass fraction in the peel and flesh of ‘Honeycrisp’ apples

(續表3 Continued table 3)

物質Chemical保留指數ΙaRI Ι保留指數ΙΙbRI ΙΙ定性Qualitative 質量分數/(μg/kg)Mass fraction果皮Peel果肉Flesh3-羥基丁酸乙酯 Ethyl 3-hydroxybutyrate1 5101 515 nMS/RI229.34605.36??己酸己酯 Hexyl hexanoate1 5991 602 nMS/RI/STD730.9229.98??辛酸丁酯 Butyl n-octanoate1 6031 604 nMS/RI331.70-??辛酸3-甲基丁酯 Isoamyl n-octanoate1 6491 658 nMS/RI98.68-??3-羥基丁酸丁酯 Butyl 3-hydroxybutyrate1 6941 684 nMS/RI35.9988.89??辛酸己酯 Hexyl caprylate1 7991 796 nMS/RI/STD139.47-??葵酸丁酯 n-Butyl decanoate1 8071 812 nMS/RI69.93-??總酯 Sum7 172.204 367.56??醇類 Alcohols1-丙醇 1-Propanol1 0411 036 nMS/RI759.031 914.15??2-甲基-1-丙醇 2-Methyl-propanol1 0911 092 nMS/RI/STD193.97441.51??1-丁醇 1-Butanol1 1451 173[14]MS/RI/STD7 684.3222 776.59??2-甲基-1-丁醇 2-Methyl-1-butanol1 2031 208 nMS/RI/STD1 241.473 739.82??1-戊醇 1-Pentanol1 2501 250 nMS/RI/STD128.40275.01??1-己醇 1-Hexanol1 3511 348[14]MS/RI/STD906.012 555.40??6-甲基-5-庚烯-2-醇 6-Methyl-5-hepten-2-ol1 4591 465 nMS/RI/STD16.6931.35??2,3-丁二醇 2,3-Butanediol1 5361 545 nMS/RI213.37410.59??1,3-辛二醇 1,3-Octanediol2 128MS/STD7 032.0334 150.35??總醇 Sum18 175.2966 294.76??醛類 Aldehyde己醛 Hexanal1 0761 083 nMS/RI/STD3 776.532 228.14??(E)-2-己烯醛 (E)-2-hexenal1 2111 216 nMS/RI/STD1 046.041 521.79??壬醛 Nonanal1 3861 396[14]MS/RI/STD885.44140.01??(E,E)-2,4-葵二烯醛 (E,E)-2,4-nonadienal1 7951 811 nMS/RI245.12-??總醛 Sum5 953.143 889.93??酸類 Acids乙酸 Acetic acid1 4631 449 nMS/RI522.13601.23丙酸 Propanoic acid1 5461 552[14]MS/RI/STD-448.34??丁酸 Butanoic acid1 6321 626[14]MS/RI/STD107.0076.02??己酸 Hexanoic acid1 8481 841[14]MS/RI/STD129.01-??總酸 Sum758.141 125.59??萜烯類 Terpenesα-法呢烯 α-Farnesene1 7401 746 nMS/RI/STD1 443.1276.02??法尼醇 Farnesol2 3502 356 nMS/RI/STD932.92-??總萜類 Sum2 376.0476.02??苯環類 Benzenoid苯乙醇 Phenethyl alcohol1 9001 869[14]MS/RI-212.41??苯酚 Phenol2 0032 000 nMS/RI1 159.01657.16??2,4-叔丁基苯酚 2,4-Di-tert-butylphenol2 3092 318 nMS/RI192.29164.44總 Sum1 351.311 034.01香氣物質總量/(μg/kg) Total volatile 35 786.1176 787.88??

注：a保留指數Ⅰ,香氣物質在VF-WAXms色譜柱上的實測保留指數；b保留指數Ⅱ.參考資料中香氣物質在VF-WAXms 色譜柱上的保留指數；n,NIST質譜庫中香氣物質在極性色譜柱上保留指數的平均值；MS.通過與NIST質譜庫質譜比對進行定性；RI,通過保留指數進行定性；STD.通過標準品進行定性；-.未檢測到；利用獨立樣本T檢驗，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

Note:aRI Ⅰ.Actual retention index on VF-WAXms column; bRI Ⅱ.reference retention index on VF-WAXms column from reference; n.the average values of retention index in polar column from NIST MS Search; MS.qualitative by comparing the mass spectrometry with the NIST library; RI.qualitative by RI; STD.qualitative by standard substance; -.not detected; independent t-test,*P<0.05， **P<0.01.

**表示數據經獨立樣本t檢驗差異極顯著(P<0.01) ** Means significant difference at 0.01 level byt-test

圖1 ‘蜜脆’蘋果果皮和果肉中各類香氣成分占總香氣成分百分比
Fig.1 Various aroma compounds percent of total aroma in the peel and flesh of ‘Honeycrisp’ apple

主成分分析是利用降維的思想，將多個指標轉化為幾個綜合指標的多元統計方法。基于‘蜜脆’蘋果果皮和果肉中香氣成分的質量分數，使用SPSS軟件進行主成分分析，并作圖(圖2)。主成分分析結果顯示，當提取兩個主成分時可以解釋原始變量總方差的94.26%，其中第一主成分(PC1)解釋總方差的90.45%，第二主成分(PC2)解釋總方差的3.81%。圖2顯示‘蜜脆’蘋果香氣成分在果皮與果肉的分布存在很大的差異，且引起差異的主要是PC1。由表4可得，PC1的線性組合為：PC1=0.06x1-0.15x2+0.16x3+…-0.16x40+0.14x41+0.05x42，除乙酸丙酯、辛酸丁酯和2,4-叔丁基苯酚外，其他變量的系數絕對值相當。PC1的線性組合的系數中，14個酯類的系數，除E-2-己烯醛外所有醛類系數以及兩個萜物質的系數均為正；而所有醇類物質變量的系數均為負。因此根據主成分分析的結果可知，‘蜜脆’蘋果果皮與果肉中香氣成分的差異主要表現在酯類、醇類、醛類以及萜類物質。結合果皮和果肉中香氣成分的質量分數可知，酯類、醛類、萜類物質集中分布在果皮，而醇類物質主要分布在 果肉。

圓點、下軸、左軸構成每種香氣成分的載荷圖 Load diagram of each aroma component with the circle,lower axis and left axis；三角形、五角星、上軸、右軸構成果皮與果肉的主成分得分圖 Principal component score map of peel and flesh composed of the triangle,pentagon,upper axis and right axis

圖2 ‘蜜脆’果皮與果肉中42種香氣成分主成分分析
Fig.2 Principle component analysis (PCA) of 42 aroma compounds
determined in the peel and flesh of ‘Honeycrisp’ apples

2.2 ‘蜜脆’果實果皮與果肉香氣值差異分析

果皮中lg(OAV)>0的物質有18 種(表5)，酯類物質有丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯和己酸己酯等12 種酯類物質，其中2-甲基丁酸乙酯的香氣值最高為27 125.34，香氣貢獻率為88.65%，是果皮中主要的呈香物質，該物質呈水果香。醛類與醇類物質有1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、己醛、(E)-2-己烯醛和壬醛，其中壬醛的香氣貢獻率僅次于2-甲基丁酸乙酯(2.89%)，呈花香。

果肉中lg(OAV)>0的物質有16 種(表5)，酯類物質有9種，其中2-甲基丁酸乙酯的香氣值最高為14 842.10，香氣貢獻率為87.93%，是果肉中主要的呈香物質，其次為呈果香的丁酸乙酯，香氣貢獻率為5.63%。果肉中lg(OAV)>0的醇類香氣物質為2-甲基-1-丙醇、丁醇、2-甲基-1-丁醇和己醇，果肉中雖醇類物質總量最高，但由于醇類物質的香氣閾值較高，導致醇類物質的香氣貢獻率累積不到1%。果肉中lg(OAV)>0的醛類為己醛、(E)-2-己烯醛和壬醛。

雖然果皮與果肉之間香氣物質的質量分數以及組成存在很大差異，但二者香氣值之間差異不明顯，主要的呈香物質均為酯類物質，其中呈果香的2-甲基丁酸乙酯的香氣貢獻最高。

表4 ‘蜜脆’果皮與果肉中42種香氣成分主成分分析因子載荷矩陣Table 4 Component matrix of principle component analysis (PCA) of 42 volatile compounds determined in the peel and flesh of ‘Honeycrisp’ apples

3 討 論

‘蜜脆’蘋果果皮中酯類和醛類物質的質量分數比果肉中的高，且種類更豐富；但果皮中醇類物質的質量分數低于果肉；這可能與果肉和果皮中相關合成底物、酶基因的表達量以及酶活性的差異相關。醇和酰基-CoA在醇酰基轉移酶(AAT)的作用下合成酯是酯類物質合成的最后一步，是一個需氧過程；因此，AAT在果皮的活性較高[3]；這可能是‘蜜脆’果皮酯類香氣物質質量分數高的一個原因。脂氧合酶(LOX)對多元不飽和脂肪酸例如亞油酸、亞麻酸有雙加氧作用，生成相應的過氧化物，然后在脂氫過氧化物裂解酶(HPL)作用下生成C6醛[20]；ECHEVERRI等[21]在研究‘富士’蘋果成熟過程中香氣成分的變化中發現：在果皮中脂氧合酶(LOX)活性顯著高于果肉；因此，‘蜜脆’果皮中以C6醛為主的醛類物質的質量分數高于果肉，可能是由于LOX在果實中不同部位的酶活性差異導致的。

表5 ‘蜜脆’果皮、果肉香氣成分香氣值的常用對數值Table 5 Volatile components lg(odor unit)in the peel and flesh of ‘Honeycrisp’ apples

注:alg(香氣值).香氣值為某種化合物含量與該化合物香氣閾值的比值，lg(香氣值)= lg(化合物含量/香氣閾值)，lg(香氣值)>0的揮發性物質被認為是該果實的特征香氣成分；b香氣貢獻.香氣貢獻值為某種化合物的香氣值與總香氣值的比值。

Note:alg(odor unit).The compound odor unit is the ratio of content to aroma threshold,lg (odor unit) = lg (amount / OTH),the volatile component with lg (odor units) >0 is regarded as the characteristic aroma components of the fruit; bAroma contribution.the aroma contribution is the ratio of aroma value of a compound to total aroma value.

支鏈酯類物質(2-甲基丁酸乙酯、乙酸2-甲基丁酯和2-甲基丁酸丁酯等)在果皮中的質量分數均高于果肉。在蘋果中，支鏈酯類物質主要來自于支鏈氨基酸亮氨酸、纈氨酸以及異亮氨酸的代謝[2]。前人研究結果表明，蘋果果實中氨基酸和脂肪酸在果皮中的含量高于果肉，尤其是異亮氨酸[9]；‘喬納金’蘋果在成熟衰老過程中，果實內異亮氨酸與其他氨基酸的變化趨勢不同，但與乙烯和支鏈酯類物質的變化趨勢一致[22]；因此，‘蜜脆’果肉和果皮中支鏈酯類物質的差異可能不僅與AAT酶活性的差異有關，也可能與生成支鏈酯的底物-支鏈氨基酸在果實中的分布不均有關。

根據人們對不同香氣成分的感官效果，水果的香氣可分為果香型、甜香型、青香型、辛香型、木香型和醛香型等[23]。蘋果根據果實芳香物質的組成分為以‘金冠’[24]為代表的“酯香型”、以“喬納金”[25]為代表的“醇香型”以及以“澳洲青蘋[26]”為代表的“青香型”[27]。“酯香型”蘋果可根據酯類物質的組成分為乙酸酯型、丙酸酯型、丁酸酯型及乙醇酯型[28]；如‘富士’香氣物質以乙酸丁酯、乙酸己酯和2-甲基丁基乙酸酯為主，是典型的“乙酸酯型”[21]。本研究中，酯類物質是影響‘蜜脆’果實香氣品質的主要物質，其香氣值在果皮和果肉中分別占總香氣值的94.21%和 95.62%。雖然在‘蜜脆’果皮和果肉中醇類物質質量分數最高，但是酯類物質香氣貢獻值最高，原因是酯類物質的氣味閾值遠低于醇類物質。因此，‘蜜脆’蘋果應歸入‘酯香型’蘋果類型。同時本研究結果表明，丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯等9種酯類物質，為‘蜜脆’果皮和果肉共有的酯類特征香氣物質，其中呈典型果香的2-甲基丁酸乙酯在果皮和果肉中香氣貢獻值最高，其次為丁酸乙酯；因此‘蜜脆’蘋果屬于“酯香型”蘋果的“乙醇酯型”。

4 結 論

采用有機溶劑萃取法并結合氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術，對‘蜜脆’蘋果不同組織的香氣成分進行分析，共檢測到42種香氣成分，包括酯類、醇類、醛類、酸類、萜類和含苯環類物質；其中酯類、醛類和醇類物質是果皮的主要香氣成分，醇類物質為果肉的主要香氣成分。綜合香氣物質譜及香氣值分析，將‘蜜脆’蘋果歸于‘酯香型’蘋果的“乙醇酯型”品種。