黑順片關節腔注射干預大鼠骨性關節炎的藥效作用*

姚 蘭 王春雷

1浙江中醫藥大學 浙江 杭州310053 2浙江省腫瘤醫院 浙江 杭州310022

附子為毛茛科植物烏頭的側根，味辛，溫，有大毒，歸腎、脾經，始見于《神農本草經》。附子乃“回陽救逆第一品”，有補火助陽，散寒止痛之功，主治陰盛格陽，大汗亡陽，風寒濕痹，臨床上常用于亡陽虛脫、肢冷脈微等。現代藥理研究發現，附子具有強心、抗心律失常、抗血栓、抗腫瘤、免疫抑制等多方藥理作用。附子化學成分復雜，主要分為生物堿類、多糖、脂質類等，其活性成分兼毒性成分為烏頭堿、次烏頭堿與新烏頭堿。因而，限制了附子在臨床上的應用。為了降低或消除附子毒性，前人采用各種炮制工藝，得到了多種加工品。黑順片即為制附子中的一種，它保留了附子大部分藥用成分，但藥性溫和。因此本實驗選用黑順片進行研究，探討黑順片對于骨性關節炎（OA）的治療效果。

1 材料

1.1 實驗動物：SD 大鼠40只，雌性，體重200±20g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016。大鼠飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心內，適應性飼養1周后開展實驗。整個實驗過程均在該實驗中心SPF級屏障環境中完成。

1.2 試劑及儀器：IMDM 培養基（HyClone）、FBS 胎牛血清（Cellmax）、PBS 磷酸鹽緩沖液（HyClone）、青鏈霉素混合液（Gibco）、碘乙酸（SIGMA-ALDRICH）、二型膠原酶（worthingyton）、EDTA 脫 鈣 液（Solarbio）、TaKaRa Prime ScriptTM RT reagent Kit，YLS-3E 電子壓痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司）、足底熱輻射測痛儀（37370，意大利UGO BASILE）、MDF-J281AT 超低溫冰箱（SANYO），DK-S12型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）、SW-CJ-1F 層流超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、AXiovert200熒光倒置顯微鏡（Olympus ckx41）、全自動多功能酶標儀（BioTek）、CO2細胞培養箱（Thermo）。

2 方法

2.1 黑順片水提物制備：取黑順片（四川江油中壩附子科技發展有限公司，生產批號180702），參照先前的研究方法對黑順片進行提取制備[1]。簡單地說，將黑順片磨成粉末，在10倍純水中浸泡30min，加熱回流提取30min。過濾后收集水提液，殘渣加入8倍水，繼續加熱回流30min。過濾收集第2次水提液。合并兩次煎液，真空減壓加熱濃縮1g/ml，水煎液以5000r/min 離心10min，取上清液即得。

2.2 高效液相測定黑順片水煎液中的3種生物堿：精密稱取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿標準品，加入二氯甲烷定容，充分搖勻溶解作為對照品溶液。取“2.1”中制備的黑順片水提液，制備成供試品溶液。色譜條件：Hypersil-BDS 柱（250.0mm×4.6mm，5.0μm）；以甲醇-水-氯仿-三乙胺（100：50：3：0.15）為流動相，流速：1ml/min，柱溫30℃，進量樣5μl。分別取適量標準品和供試品溶液進行檢測。

2.3 大鼠原代軟骨的分離提取：取3周齡SD 大鼠脫頸處死，置于75%酒精中浸泡5min。將取出的膝關節置于PBS 中洗凈。無菌條件下，用手術刀片分離出軟骨關節面。分離出的軟骨用PBS清洗3次后，用手術剪將其剪碎至1mm3大小，裝入試管中。先用0.25%胰蛋白酶37℃水浴消化30min，后換0.20%二型膠原酶消化4h，每30min振蕩1次。終止消化，采用DMEM培養液，加入10%胎牛血清，青霉素100u/ml，鏈霉素100u/ml。用70μm細胞篩網過濾，濾液離心，棄上清。將得到的細胞團塊重懸后，接種于培養瓶中，置于37℃培養箱中培養，觀察貼壁情況，換液傳代后備用。

2.4 造模及給藥處理：將30只SD 大鼠隨機分為空白組、OA 模型組、黑順片治療組（200μg/ml），每組10只。OA 模型組、黑順片治療組大鼠通過向雙側膝關節腔內各注射25mg·ml-1碘乙酸50μl 進行OA 造模，對空白組大鼠雙側膝關節腔內各注射25mg/ml 生理鹽水50μl。造模1周后，向黑順片治療組大鼠雙側后肢膝關節腔分別注射50μl黑順片水提物，向空白組和OA模型組大鼠膝關節腔注射等量生理鹽水，每周1次，共注射4次。4周后，處死大鼠，進行取樣分析。

2.5 檢測指標：分述如下。

2.5.1MTT：取2代大鼠原代軟骨細胞，消化計數，調整細胞濃度為1.5×104/ml，接種到96孔板中，置于37℃培養箱中進行培養。待細胞貼壁后，進行藥物干預。設置空白組，多濃度梯度黑順片水提物組（分別為100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml）。24h后，采用MTT法檢測細胞活性，并繪制細胞增殖曲線。

2.5.2壓痛實驗：應用YLS-3E 電子壓痛儀測定大鼠的痛閾。將大鼠裝入固定桶內，使動物處于舒適又起固定作用的狀態，用扁型頭對大鼠雙側后足背施壓，當動物因疼痛出現鳴叫或掙扎時顯示的壓力值即為此動物的痛閾值。實驗開始前測定基礎痛閾，于造模后的第4周測定痛閾。

2.5.3熱痛實驗：應用足底熱痛敏測試儀檢測大鼠雙側后足趾熱痛閾值。測量時，將大鼠置于透明有機玻璃箱內，室溫保持在25±2℃。大鼠安靜后（停止梳理毛發和探索性活動），將測試儀上的“十”字形標記置于大鼠左后跖足底中央并避開足墊。開啟儀器，從開始至大鼠出現抬腿回避的時間作為大鼠的熱痛閾值。每只腳照射3次，每次間隔5～6min。為防止大鼠被熱輻射燙傷，我們將熱痛閾值測定的時間上限值設定為20s，溫度上限值設定為35℃。實驗于每次壓痛實驗后的6h進行測定。

2.5.4組織病理學：造模后4周，將所有大鼠處死，取出膝關節，4%多聚甲醛固定48h，然后用EDTA脫鈣4周。脫鈣完成后，酒精逐級脫水，石蠟包埋，切片取樣。切片常規脫蠟至水，經蒸餾水沖洗后進行番紅O染色、封片。光鏡下觀察組織病理學改變。參照Mankin’s 軟骨組織學評分標準進行Mankin’s評分。

2.6 統計學方法：實驗數據以均數±標準差（mean±SD）表示，采用SPSS20.0進行多重比較分析。大鼠的痛閾值檢測、Mankin’s 評分、吸光度總體比較均采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD 檢驗，兩兩比較均采用student-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 高效液相色譜圖：取供試品進樣檢測，所得色譜圖如圖1所示。

圖1 水煎30min黑順片HPLC色譜圖

3.2 MTT 細胞活性：黑順片水提物直接作用大鼠原代軟骨細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。從圖224h、48h 細胞增殖曲線可知，當黑順片水提物濃度為200μg/ml 時，大鼠原代軟骨細胞的增殖率達到峰值。當水提物濃度低于200μg/ml時，其對原代軟骨細胞的增殖率呈依賴性增長；當水提物濃度高于200μg/ml時，其增殖作用有所下降。水提物濃度為1000μg/ml時，在作用24h 后，對大鼠原代軟骨細胞無明顯增殖效果。黑順片水提物對細胞處理時間達到48h，在800μg/ml時，增殖率為0；當水提物濃度為1000μg/ml時，出現了抑制大鼠原代軟骨細胞生長的效果。

3.3 壓痛閾值和熱痛閾值檢測結果：疼痛行為學指標檢測結果如圖3所示，3組大鼠的壓痛、熱痛閾值比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。與正常組相比，碘乙酸模型組的壓痛閾值和熱痛閾值低于正常組，證明大鼠疼痛骨性關節炎模型制備成功。經黑順片水提物的治療，其壓痛閾值和熱痛閾值顯著提高（P＜0.01），有效緩解大鼠的疼痛。

圖2 不同濃度黑順片水提物對軟骨細胞作用結果

圖3 大鼠熱痛閾值和壓痛閾值

3.4 病理學結果與Mankin’s評分結果：如圖4所示，對照組大鼠膝關節面光滑完整，軟骨細胞排列規整，軟骨下骨中骨小梁形態及分布正常。而在OA 模型組的大鼠膝關節發現嚴重的關節退變，伴隨著關節軟骨喪失，軟骨細胞損失，膠原破壞。與模型組相比，黑順片治療組有效地逆轉了這種損傷，軟骨面光滑完整，軟骨細胞排列整齊。

相應的Mankin’s 評分結果顯示，正常組得分低于模型組（P＜0.01），黑順片治療組得分也低于模型組（P＜0.01），如圖5所示。

圖4 大鼠膝關節軟骨組織病理切片（番紅染色×100）

圖5 大鼠膝關節軟骨組織病理Mankin’s評分

4 討論

中醫學認為，OA 屬于“骨痹”“痛痹”范疇，肝腎陽虛是本病發病基礎之一，風寒濕邪侵襲及跌撲扭傷為發病誘因。因此，治療骨性關節炎的關鍵在于補腎扶陽、驅寒除濕[2]。《神農本草經疏》言“附子，藥性大熱而善走，故亦善除風寒濕三邪，三邪祛則諸證自療矣”。黑順片是附子最常見的炮制品，被廣泛應用于臨床，主要用于散寒止痛、抗關節炎等。本實驗中，黑順片經過減毒處理，使其毒性大大降低，但依舊保留其有效成分。實驗觀察黑順片水提物對大鼠軟骨細胞的活性影響，發現黑順片水提物對大鼠軟骨細胞有較強的促增殖作用，且存在峰值，即200μg/ml。大于800μg/ml高濃度的黑順片水提物出現抑制的作用，可能是水提物中的有毒成分含量過高，作用時間過長導致。此結果為附子解毒后的安全范圍、作用時間提供了依據，提示了在應用黑順片過程中，應兼顧用藥劑量和用藥時間。

碘乙酸誘導的大鼠模型是一種微創且成模塊的骨性關節炎模型，再現了組織形態學和功能關節損傷以及類似人類的疼痛行為。通過關節腔注射不同劑量的碘乙酸，可人為控制模型中骨性關節炎病變的嚴重程度。通過關節腔注射法注射適量碘乙酸后，大鼠機械痛和熱痛的閾值明顯下降，由此確定成功制備疼痛骨性關節炎模型。關節腔注射給藥是一種常見的給藥方式，臨床上用于治療骨性關節炎、關節創傷等癥，該方法極大地改善胃腸道不良反應，提高生物利用度。藥物直接作用靶點的同時，也提高了用藥安全性。本研究中，利用碘乙酸模型確定黑順片水提物對大鼠骨性關節炎的治療作用。實驗采用關節腔注射給藥的方式，可以大大降低黑順片對大鼠產生的毒性影響，且治療靶點明確。結果顯示，黑順片治療組的軟骨破壞程度減輕，軟骨細胞損失減少。根據疼痛結果顯示，黑順片能有效提高膝關節炎的痛域。提示黑順片可以修復受損關節軟骨，恢復關節功能，有效減輕OA寒濕痹阻證大鼠的膝關節疼痛癥狀，且效果顯著。

黑順片水提物中抗OA 作用的有效成分還需要進一步研究。對于黑順片保護軟骨細胞，促進軟骨再生，以及受損關節軟骨修復過程和機制還未可知，需要深入探討。