微囊藻毒素對水稻幼苗營養吸收的影響

劉洪月，申澤輝，梁嬋娟*

（1.江蘇省厭氧生物技術重點實驗室，江南大學環境與土木工程學院，江蘇 無錫214122；2.江蘇省水處理技術與材料協同創新中心，江蘇 無錫214122）

近年來，我國許多大型淡水湖泊和水庫中藍藻水華爆發頻繁，藍藻細胞衰亡后會產生多種毒素[1]。其中，微囊藻毒素（Microcystins，MCs）是出現頻率最高、產量最大和危害最嚴重的一類藻毒素[2]。MCs通過灌溉等方式進入農田生態系統，直接影響農作物生長和糧食生產。在灌溉水中，MCs濃度通常超過世界衛生組織（WHO）允許的標準值1 μg·L-1，常見濃度范圍為4～50 μg·L-1，在藍藻大量死亡的極端情況下甚至高達6500 μg·L-1[3]。近年來，許多研究報道了MCs 對陸地植物的影響，包括抑制種子萌發、損害組織發育和降低作物產量[4-5]，涉及機理集中在抑制蛋白磷酸酶活性[6]、氧化應激和降低光合作用等方面[7]。本項目組前期研究表明低濃度MCs（1 μg·L-1）促進了水稻幼苗的生長，與提高PSⅡ的光化學活性和光合電子傳遞及增加葉綠素含量有關。高濃度MCs（≥1000 μg·L-1）對水稻幼苗的生長造成不可逆傷害，與膜脂過氧化和光合功能受損有關[8-10]。而植物中光合系統和抗氧化系統氧化與營養元素的吸收、分布和轉運密切相關[11]。質膜H+-ATP 酶是植物營養吸收的主宰酶，通過水解ATP 產生能量將H+泵出細胞，在細胞膜兩側形成的質子驅動勢，為營養元素跨膜運輸提供原初動力[12]。然而目前鮮有關于MCs 對植物營養吸收的影響及其內在機制的報道。水稻作為第一大糧食作物，其用水量大，較其他作物更易受MCs 污染的影響[13]。因此本研究以水稻為試材，以質膜H+-ATP 酶為切入點，結合根系活力和ATP 含量的變化，探究MCs 對植物營養吸收的影響。本文研究結果不僅為豐富MCs對植物的致毒機理提供新的佐證材料，而且為減輕MCs對植物造成的傷害提供新的思考方向。

1 材料與方法

1.1 藻毒素的制備

從無錫太湖打撈站取新鮮藍藻，將藍藻烘干、制粉保存。稱取1 g干燥的藻粉，加入40 mL 5%的冰乙酸，室溫抽提2 h，8000 r·min-1離心10 min，沉淀用40 mL 5%冰乙酸繼續抽提，重復2次，合并3次抽提的上清液，調節pH 為3.0，離心去除雜質蛋白，調節pH 為7.0，將粗提取液過Sep-pak C18 柱固相萃取（500 mg·6 mL-1，Waters corporation，美國）。采用高效液相色譜法（Ultimate 3000，Dionex corporation，美國）測定MCs 的組成，發現MC-LR、MC-RR 和MC-YR 有明顯出峰，且峰值穩定。采用酶聯免疫法ELISA（Microcystins plate kit，Beacon Analytical Systems Inc，Saco，ME）測量粗提液中MCs的濃度[8]。

1.2 試材培養

水稻（Oryza sativa）試驗材料選擇“淮稻8 號”。選擇籽粒飽滿的水稻種子用HgCl2（0.1%，W∕V）消毒10 min，洗滌3 次后在去離子水中浸泡8 h，置于恒溫培養箱（25 ℃）中催芽3 d。將幼芽置于蛭石中培養至兩葉一心時轉移至周轉箱（6.88 L）中水培。營養液采用常規營養液配方，其組分為150 mmol·L-1（NH4）2SO4、24 mmol·L-1KH2PO4、42 mmol·L-1K2SO4、120 mmol·L-1CaCl2·H2O、120 mmol·L-1MgSO4·7H2O、60 mmol·L-1Na2SiO3·9H2O、1.08 mmol·L-1MnCl2·4H2O、2.4 mmol·L-1H3BO3、2.40 mmol·L-1Fe（Ⅲ）-EDTA，46.82 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O、92.39 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、38.40 μmol·L-1CuSO4·5H2O[14]。營養液每3 d更新一次。待幼苗長至4葉1心（此時已結束返青，水稻生長旺盛，是營養生長的關鍵時期）時，進行MCs處理[15]。

1.3 試材處理

將高濃度藻粉粗提液用營養液分別稀釋成不同MCs 濃度（1、10、100、1000 μg·L-1），以不含MCs 的營養液作為對照。將水稻幼苗在含有不同濃度MCs 的營養液中連續培養7 d（脅迫期），取樣進行各指標的測定。將剩余水稻幼苗移至對照條件下培養7 d（恢復期），再取樣測定。

1.4 指標測定

營養元素含量測定：用電感耦合等離子體發射光譜儀（Perkin Elmer Corp，Norwalk，CT，美國）測定鉀（K+）、鈉（Na+）、鈣（Ca2+）、鎂（Mg2+）、鐵（Fe2+）、鋅（Zn2+）、銅（Cu2+）含量[16]。PO3-4含量的測定用鉬藍比色法[17]；NH+4-N 含量的測定采用靚酚藍法[18]；NO-3-N 含量的測定采用水楊酸法[19]。根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）脫氫酶法[20]。ATP含量用高效液相色譜儀（Ultimate 3000，Dionex corporation，美國）測定[17]。質膜H+-ATP酶活性的測定采用無機磷含量法[21]。于水稻幼苗根尖取樣，用Trizol 試劑提取RNA，以反轉錄合成的cDNA 的第一鏈為模板，進行PCR 擴增循環。引物序列和擴增程序參照參考文獻[17]。基因相對表達量采用2-△△CT法進行計算。每個處理重復3次，每次測定重復3次。

1.5 數據處理

所有數據均為3 次獨立試驗的平均值±標準差（Mean±SD）。試驗數據采用SPSS 16.0和Origin 8.5軟件進行統計分析和繪圖，不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結果與討論

2.1 MCs對水稻幼苗營養物質含量的影響

礦質營養元素參與細胞的組成、酶的活化和調控生理過程[22]。如表1 所示，脅迫7 d 后，1 μg·L-1MCs組水稻幼苗中礦質營養（K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、PO34-、NO-3和NH+4）含量無顯著變化。10 μg·L-1MCs 組水稻幼苗中Mg2+、Fe2+、Zn2+、NO-3和NH+4含量增加，PO3-4含量降低。推測原因如下：10 μg·L-1MCs 增強了礦質元素跨膜運輸的驅動；植物中礦質元素的吸收與其轉運通道及蛋白有關，因此10 μg·L-1MCs 處理還可能通過影響Mg、Fe、Zn和N轉運蛋白家族的表達來增強植物對MCs脅迫的適應性[23-24]。Mg2+、Fe2+和Zn2+是葉綠素生物合成和光合作用的必需元素[25]，10 μg·L-1MCs 脅迫下水稻中Mg2+、Fe2+和Zn2+含量的增加利于維持地上部光合作用以適應MCs 脅迫。同時N 元素的增加利于提高酶活性調節激素含量，如生長素（IAA）和玉米素（ZT），從而有助于調節水稻的生長[26]。由于植物中Fe、Zn與P存在競爭作用和拮抗作用[27-28]，該處理水稻中Fe2+、Zn2+含量的增加可能造成PO3-4含量的降低。這些營養元素含量的變化是水稻幼苗對10 μg·L-1MCs脅迫的適應性機制之一。100 μg·L-1MCs 組水稻幼苗中K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、PO3-4和NO-3的含量降低，Ca2+、Fe2+和NH4+含量增加，造成營養元素失衡。Freitas 等[29]用100 μg·L-1MC-LR 處理生菜，10 d 后發現葉中礦質元素（Mg、K、P、Mn、Fe、Zn、Cu 和Mo）含量均降低。這表明MCs 處理下植物中營養物質含量的變化并不一致，可能與植物物種、發育階段、毒素性質和暴露時間等有關。1000 μg·L-1MCs組水稻幼苗中除Ca2+含量增加外，其他元素含量均降低，且降幅大于100 μg·L-1MCs組。Ca作為植物信號傳導的第二信使，其含量的增加有助于與鈣結合蛋白作用，發揮Ca2+的傳感器功能，結合基因啟動子中的順式元件來調節植物對逆境的應激反應[30]。結合本項目組前期的報道[8-9]，高濃度MCs（100 μg·L-1和1000 μg·L-1）處理下礦質營養元素的失衡可能與水稻幼苗體內MCs的高積累有關，是造成水稻幼苗光合作用和生物量積累受抑的又一重要原因。

恢復7 d 后，1 μg·L-1和10 μg·L-1MCs 組水稻幼苗中各礦質營養元素含量均在對照水平。100 μg·L-1MCs 組水稻幼苗中礦質元素含量較脅迫期有所恢復，利于水稻生長的自我修復，這與我們前期的研究相一致[8]。1000 μg·L-1MCs 組水稻幼苗中礦質元素含量較脅迫期恢復程度較小。由此表明，解除MCs 暴露后植物營養物質的恢復受MCs 暴露濃度制約。

2.2 MCs對水稻幼苗根系活力的影響

根系活力反映根系吸收水分和營養元素的能力[31]。如圖1 所示，脅迫7 d 后，1 μg·L-1MCs 組水稻幼苗根系活力增加，這與我們前期研究結果相一致[8]。10 μg·L-1MCs 組水稻幼苗根系活力增加，且增幅大于1 μg·L-1MCs 組，推測此處理刺激了根系中物質的合成，增強根系的代謝能力，這可能是水稻幼苗對低濃度MCs 脅迫的一種適應性機制。100 μg·L-1和1000 μg·L-1MCs 組根系活力顯著降低，且降低程度隨著MCs 濃度的增大而增強。此處理根系活力的降低可能與水稻根細胞功能受到破壞，以及根表形貌和生長受到抑制有關[8]，進而不利于根系吸收水分和營養物質。

表1 MCs對水稻幼苗礦質營養含量的影響Table 1 Effect of MCs on mineral element content of rice seedling

恢復7 d 后，1 μg·L-1和10 μg·L-1MCs 組水稻幼苗根系活力恢復至對照水平，利于水稻營養吸收的正常進行。100 μg·L-1MCs 組水稻幼苗根系活力較脅迫期增加，有利于水稻營養吸收能力的自我恢復。而1000 μg·L-1MCs組根系活力低于對照且低于脅迫期，表明高濃度MCs 暴露對水稻幼苗根系功能造成了不可逆的傷害。

2.3 MCs 對水稻幼苗根系ATP 含量和質膜H+-ATP 酶活性的影響

質膜H+-ATPase 通過水解ATP產生能量，為營養物質跨膜運輸提供電化學勢梯度[12]。前期研究表明，酸雨脅迫下植物營養元素的含量與質膜H+-ATPase的活性呈正相關關系[17]。如圖2 所示，脅迫7 d 后，1 μg·L-1MCs 組水稻根系ATP 含量和質膜H+-ATPase活性無顯著變化，與該處理下營養元素無顯著變化相一致。結合根系活力的變化，表明1 μg·L-1MCs 處理下水稻中營養元素含量的變化可能主要受質膜H+-ATPase 活性的調控。10 μg·L-1MCs 處理導致質膜H+-ATPase 活性顯著上升，加快了ATP 的水解，泵出更多的H+增強電化學勢梯度。陳穎等[32]發現，在鎘脅迫下龍葵通過調節質膜H+-ATPase 活性改變體內N、P 和K 的含量，從而起到對Cd 脅迫的解毒作用。因此，質膜H+-ATPase 還可以通過調節營養元素（Mg2+、Fe2+、Zn2+和NO-3）的吸收來增強水稻幼苗對MCs 脅迫的耐受性。100 μg·L-1與1000 μg·L-1MCs 處理導致ATP 含量和質膜H+-ATPase 活性顯著降低，且降低程度隨著MCs 濃度的增大而增強。推測高濃度MCs 抑制了水稻根系中ATP的合成，使質膜H+-ATPase 活性降低，泵運H+的功能受損，不利于為礦質營養元素的跨膜運輸提供能量[10]。

圖1 MCs對水稻幼苗根系活力的影響Figure 1 Effect of MCs on root activity of rice seedling

恢復7 d 后，10 μg·L-1MCs 組水稻根系質膜H+-ATPase 活性和ATP 含量恢復至對照水平，是礦質營養元素恢復的又一重要原因。100 μg·L-1與1000 μg·L-1MCs 組H+-ATPase 活性和ATP 含量仍顯著低于對照，但較脅迫期有所增加，其中1000 μg·L-1MCs 組較脅迫期增加程度較小。解除MCs 暴露后植物營養吸收的恢復程度與MCs 處理濃度、MCs 積累量、不同生育期和不同器官等因素有關[33]。通過對礦質營養元素含量與質膜H+-ATPase活性進行相關性分析（表2）發現，在脅迫期和恢復期質膜H+-ATPase 活性與Ca2+含量呈顯著負相關，與其他礦質元素均呈顯著正相關。其中K+、Na+、Mg2+、Zn2+、PO3-4、NO-3的吸收受質膜H+-ATP 酶活性影響較大。上述結果表明，MCs 脅迫導致的水稻幼苗中營養元素含量的變化受質膜H+-ATPase活性的調控。

圖2 MCs對水稻幼苗根系ATP含量和質膜H+-ATPase活性的影響

2.4 MCs對水稻幼苗根系質膜H+-ATPase基因表達的影響

水稻中質膜H+-ATPase 由多基因家族編碼，并且已鑒定出5個不同的亞家族Ⅰ（OSA1、2、3），Ⅱ（OSA5、7），Ⅲ（OSA9），Ⅳ（OSA4、6、10）和Ⅴ（OSA8）[34]。由圖3可知，脅迫7 d后，1 μg·L-1MCs組水稻根系質膜H+-ATPase 的編碼基因OSA1、OSA3 和OSA8 的相對表達量雖顯著上調，但質膜H+-ATPase 活性無變化。這可能由于質膜H+-ATPase 的活性不僅與轉錄水平有關，還受翻譯和磷酸化修飾等過程的調控[35]。在正常條件下，植物中亞家族Ⅰ（OSA1、2、3）和Ⅱ（OSA5、7）通常為高表達，Ⅲ（OSA9），Ⅳ（OSA4、6、10）和Ⅴ（OSA8）通常為低表達[36]。10 μg·L-1MCs 處理OSA1、OSA2、OSA3、OSA4、OSA6、OSA8、OSA9 的相對表達顯著上調，這可能是水稻對MCs脅迫的一種適應性機制。結合該處理質膜H+-ATPase 活性變化可知，10 μg·L-1MCs 誘 導 亞 家 族Ⅰ（OSA1、2、3），Ⅲ（OSA9），Ⅳ（OSA4、6）和Ⅴ（OSA8）的表達上調可能是質膜H+-ATPase 活 性 增 加 的 原 因。100 μg·L-1MCs 組 除OSA2、OSA3 和OSA9 外，其他基因的相對表達量均顯著下調。結合質膜H+-ATPase 活性降低可知，亞家族Ⅰ（OSA1），Ⅱ（OSA5、7），Ⅳ（OSA4、6、10）和Ⅴ（OSA8）的表達下調可能是質膜H+-ATPase 活性降低的原因。1000 μg·L-1MCs 組各基因的相對表達量均顯著下調，且下調幅度大于100 μg·L-1MCs 處理組，與1000μg·L-1MCs 組質膜H+-ATPase 活性低于100 μg·L-1MCs 組的結果相一致。結合之前的報道可知[9]，MCs（100 μg·L-1和1000 μg·L-1）脅迫水稻根系質膜H+-ATP 酶基因表達下調，不利于質膜H+-ATP 酶活性增加，進而阻礙植物對礦質元素的吸收，是高濃度MCs處理下水稻生物量下降的重要原因之一。

表2 水稻幼苗中礦質營養元素含量與質膜H+-ATPase活性的相關性Table 2 Correlations between mineral element content and plasma membrane H+-ATPase activity in rice seedlings

圖3 MCs對水稻幼苗根系質膜H-ATPase基因表達的影響Figure 3 Effect of MCs on the expression levels of genes encoding plasma membrane H+-ATPase in rice seedling roots

恢復7 d 后，1 μg·L-1MCs 組水稻根系中OSA1和OSA3 相對表達量仍高于對照而低于脅迫期，OSA10 相對表達量仍低于對照組。10 μg·L-1MCs處理組OSA2、OSA3、OSA4、OSA8 和OSA9 的相對表達量顯著低于對照且低于脅迫期，其他基因表達恢復至對照水平，利于調節根系質膜H+-ATPase 活性的 自 我 恢 復。100 μg·L-1MCs 組OSA1、OSA4、OSA5、OSA6 和OSA8 相對表達量較脅迫期增加，與質膜H+-ATPase 活性較脅迫期增加一致。1000 μg·L-1MCs OSA1、OSA4、OSA6 相對表達量較脅迫期增加，而OSA3、OSA5、OSA7 和OSA10 相對表達量低于脅迫期。推測高濃度MCs 損傷了質膜H+-ATPase 的構象和功能[17]，對編碼H+-ATPase 的基因轉錄水平造成了不可逆的抑制，進而不利于質膜H+-ATPase活性的增加。通過對比質膜H+-ATPase 基因表達和質膜H+-ATPase 活性的一致性，發現亞家族Ⅰ（OSA1），Ⅳ（OSA4、6）和Ⅴ（OSA8）能較好地響應MCs 脅迫，對調控質膜H+-ATPase 活性的變化具有重要作用。

3 結論

（1）低濃度MCs（1 μg·L-1）對水稻幼苗質膜H+-ATPase 和礦質營養含量無影響。10 μg·L-1MCs 處理組質膜H+-ATPase 基因表達的上調有益于質膜H+-ATPase 活性上升，促進水稻對礦質營養的吸收，增強了水稻幼苗對MCs 脅迫的適應性，經7 d 后恢復至對照水平。

（2）高濃度MCs（100 μg·L-1和1000 μg·L-1）處理組通過下調質膜H+-ATPase 基因表達量來降低質膜H+-ATPase 活性，阻礙了水稻對礦質元素的吸收。恢復7 d 后100 μg·L-1MCs 組各項指標優于脅迫期，而1000 μg·L-1MCs 對水稻根系營養吸收造成不可逆傷害。表明恢復效果與MCs濃度有關。

（3）MCs 脅迫下質膜H+-ATPase 活性變化調節了根系對營養元素的吸收，進而增強了植物對MCs脅迫的適應性。