外源硒對萘脅迫下車前草生長及土壤修復能力的影響

朱 燦，劉慧剛，顧 彥，席 穎，任 東，黃應平*

（1.三峽大學水利與環境學院，湖北 宜昌443002；2.湖北省農田監測工程技術中心，三峽大學，湖北 宜昌443002；3.三峽庫區生態環境教育部工程研究中心，三峽大學，湖北 宜昌443002）

多 環 芳 烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類常見的有機污染物，它們廣泛存在于空氣、水、土壤和沉積物中，而且在環境中長時間停留[1]，具有致癌性、致畸性和誘變性的特點。多環芳烴容易在土壤、沉積物和污水污泥中積累[2]，一旦進入環境中，將會威脅到植物、動物及人類的健康[3]。

萘（Naphthalene，Nap）是多環芳烴中分子量最低的一種持久性有毒有機污染物，由兩個苯環組成，被美國環境保護署列入16 種優先控制污染物清單[4]。在未被污染的土壤中測得萘的含量較低，僅有1～20 μg·kg-1，但部分受到污染的地點附近含量最高可達到6410 mg·kg-1[4]，對環境和生物造成嚴重危害。萘容易被植物根部吸收，對植物的發芽和生長有著抑制作用[5]。因此，修復土壤中萘污染日益成為環境保護的熱點問題之一。

為了治理多環芳烴污染物，物理修復、化學修復、自然衰減、生物修復等方法相繼被提出，并取得了一定成效[6]。在這些方法中，植物修復的優點在于環境友好、經濟可行、能量消耗少，具有推廣應用的基礎[7]。利用植物修復大面積污染場地的實例顯示，該方法不僅成本低廉，同時也可以改善污染地周圍土壤環境[8-9]。目前，植物修復土壤污染的方式一般有以下幾種：植物單作或套作、植物-微生物聯合修復、添加土壤改良劑強化植物修復等[10-11]。其中植物單作或套作修復無法應用于較高濃度的污染土壤，因為多環芳烴能在植物根部形成膜而阻止養分、水分的吸收，使植物生長受到嚴重抑制[12]；而植物-微生物聯合修復的缺點在于微生物有時無法適應自然條件下的PAHs污染土壤，含水量、溫度、pH 值等難以人為控制的因素可能導致微生物無法正常生長、繁殖[13]。這些研究中植物無法適應重度污染的場地，修復效果也有限，因此，為拓寬植物修復的應用范圍，通過添加增強植物對重度多環芳烴污染的耐受能力成為植物修復的一個研究方向。

硒是一種類金屬元素，被世界衛生組織和國際營養組織確定為人類和動物必需的微量營養元素。硒雖不是植物的必需元素，但由于其具有抗氧化性，對植物的生長有著積極作用，尤其是在應激環境下。研究表明，適量的硒能通過增強植物體內抗氧化系統的活力，調節植物體內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的累積，從而提高植物在重金屬、干旱、高溫等脅迫下的適應能力和耐受性[14-16]。盡管許多研究報道了硒對增加產量、促進植物生長的積極作用，但是關于硒對多環芳烴脅迫下植物響應機制和降解效果的影響報道不多。

車前草，又名車輪菜，二年生或多年生草本植物，在我國分布范圍廣。由于其生長迅速，適應能力強，有潛力用于污染土壤的植物修復[17]。本文以車前草為試驗對象，通過向低硒土壤中添加外源硒，提高土壤含硒量，研究外源硒添加后車前草對萘污染土壤的響應機制和修復效果的影響，探究多環芳烴脅迫下植物的耐受性機制，為多環芳烴污染地區的生物治理提供一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

車前草采集于三峽大學植物園內，選擇同一批種子萌發的車前草，采長勢相近的健康植株用于試驗。供試土壤取自于三峽大學植物園，自然風干后過篩，去除碎石雜質。測得土壤理化性質為：pH 為7.38（土水比1∶5），TP 為445.1 mg·kg-1，TN 為316 mg·kg-1，有機質為2.79 g·kg-1，Se 為0.02 mg·kg-1，多環芳烴未被檢測出（檢出限為5 μg·kg-1）。亞硒酸鈉和萘購買于美國Sigma公司，純度＞98%，多環芳烴標液、二氯甲烷（色譜純）、正己烷（色譜純）、乙腈（色譜純）、層析硅膠（100～200 目）、無水硫酸鈉、丙酮、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀購置于Aladdin試劑公司。

1.2 試驗設計

將萘溶于丙酮溶液，添加到風干的土壤中。先取部分土壤配制成高濃度母土，置于通風櫥中12 h，待丙酮充分揮發，再將母土與試驗用土攪拌均勻，萘的濃度設置參考了Smith 等[18]和李玉龍等[19]的研究，配制萘濃度為0、50、200、800 mg·kg-14 個梯度的試驗用土。選取規格為底徑23 cm，高15 cm 的PVC 不透水實驗用盆，每盆裝入3 kg土壤。

研究表明，硒從有益作用到有害作用的濃度范圍很窄，適量濃度下硒對植物的生長發育、光合和呼吸作用、提高抗逆能力等方面有著促進作用，濃度超過一定范圍時反而有毒害作用[20-21]。硒的濃度設置參考了Wang等[22]的研究，向土壤中添加外源硒，使缺硒土壤（低于0.1 mg·kg-1）的含硒量達到適量水平（0.2～0.4 mg·kg-1）。亞硒酸鈉配制成水溶液添加到土壤中，每個濃度梯度設置無硒組和加硒組，無硒組中不添加外源硒，加硒組中硒的加入量為0.2 mg·kg-1。每個處理重復3次。

選擇長勢一致且健康的車前草幼苗栽入盆中，每盆3 株，每種處理設置無植物對照組，萘和硒的添加濃度與植物組相同，移至植物園內培養60 d，植物園內高溫為15～25 ℃，低溫為6～10 ℃，空氣相對濕度在60%左右，期間每隔2 d 隨機移動花盆位置，定期澆水，保持土壤水分含量維持在60%田間持水量。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物質量和長度測定

栽種60 d后測量植物質量和長度，將車前草整株從土中取出，小心抖落根系上附著的土壤，然后依次用蒸餾水和去離子水充分清洗植物表面，洗去土壤殘留，擦拭干凈，分成地上部分與根部兩個部分，分別測量地上部分及根部的長度和質量。

1.3.2 根系形態測量

根系測量采用MICROTEK MRS—9600TFU2L 掃描儀（上海中晶科技有限公司），使用LA-S 植物根系分析系統（萬深科技有限公司）分析根表面積、根體積、根尖數和平均直徑。

1.3.3 生理指標測定

取0.5 g 新鮮植物組織在手動勻漿器中磨碎，其中加入2 mL 預冷的磷酸鹽緩沖溶液，然后勻漿在4 ℃3500 r·min-1條件下離心10 min，取上清液用于過氧化氫酶（Catalase，CAT）、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的測定。分別使用CAT、GSH、MDA 和總蛋白試劑盒測得，試劑盒購買于南京建成生物工程研究所。

CAT活性測定采用可見光法，以每毫克蛋白每秒分解的H2O2數量表示一個單位的過氧化氫酶活性，單位為（FW）mg-1protein。GSH 的測定利用二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應產生黃色化合物，測定420 nm 下的吸光度，單位為（FW）mg·g-1protein。MDA 含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定，含量用（FW）nmol·mg-1protein表示。

1.3.4 土壤中萘的提取與測定

取5 g土樣于離心管中，加二氯甲烷超聲萃取（功率為40 kHz），4000 r·min-1離心10 min，取上清液。上述步驟重復3 次。上清液溶劑置換為正己烷，濃縮至1 mL，過硅膠層析柱分離凈化，濃縮液用1∶1 的二氯甲烷和正己烷洗脫，用旋轉蒸發儀將溶劑置換為乙腈，過0.22 μm 濾膜后采用Waters e2696 高效液相色譜儀（HPLC）進行測定，具體方法參照文獻[23]。進樣量為20 μL，流速為1.5 mL·min-1，柱溫為30 ℃。參照《土壤和沉積物 多環芳烴的測定高效液相色譜法》（HJ 784—2016），測得標準替代物回收率為81.9%～105.3%。萘在土壤中的去除率=（試驗初始土壤萘含量-試驗完成時土壤萘含量）∕試驗初始土壤萘含量×100%

1.4 數據分析

Microsoft Excel 2013 用于數據前期整理，Graphed Prism 7 用于圖表制作，SPSS 19 軟件用于統計學分析，采用單因素方差分析顯著性差異（P＜0.05），所有數據均為3次重復的平均值。

2 結果與分析

2.1 硒對不同濃度萘脅迫下植物生長狀況的影響

通過測定植物的質量和長度，研究萘和硒的添加對車前草生長的影響。如圖1 所示，在無污染土壤中，車前草長勢最好，加硒組與無硒組之間的質量、長度差異不明顯（P＞0.05）。隨著土壤中萘濃度的增加，植物地上部分和根部的生長受到抑制，當萘濃度達到800 mg·kg-1時，抑制作用最明顯。地上部分的質量與長度趨勢相近，與無污染條件相比，車前草質量和長度受抑制程度隨著萘濃度的增大而變強，在800 mg·kg-1組中質量降幅達57.2%，長度抑制了65.4%。根部質量在50 mg·kg-1組中下降趨勢不明顯，為3.6%，在200 mg·kg-1與800 mg·kg-1組中分別降低16.0%和54.4%。根部長度在50 mg·kg-1與200 mg·kg-1組中降幅較為輕微，最大降幅出現在800 mg·kg-1組中，達到69.5%。硒的加入改善了萘對植物的脅迫，除對照組（0 mg·kg-1）外，加硒組地上部分質量與無硒組相比均有顯著增長（P＜0.05），分別達17.5%、21.0%和54.7%，硒對根部質量的影響在800 mg·kg-1組有顯著效果（P＜0.05）。根部長度顯著增長出現在50、200 mg·kg-1與800 mg·kg-1組中（P＜0.05），硒的添加使得地上部分長度分別增長了32.9%、40.5%，根部長度增長了15.5%和38.3%。

2.2 硒對萘脅迫下植物根系形態的影響

萘脅迫下車前草的根系形態變化見圖2，與植株質量、長度變化趨勢相似，根系形態各指標隨萘濃度的增加均顯示出下降的趨勢。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1萘脅迫對根表面積的抑制作用不明顯，僅有2.6%，200 mg·kg-1和800 mg·kg-1脅迫下根表面積減少了24.4%和45.5%。如圖2A所示，加硒處理使得所有萘濃度組中根表面積較無硒組顯著增大（P＜0.05），200 mg·kg-1處理時增幅最大，達40.9%。從圖2B 可看出，根體積在萘脅迫下加硒組和無硒組均呈下降趨勢，與根表面積變化相似，加硒組根體積均比同濃度處理下無硒組中有了顯著增大（P＜0.05），在800 mg·kg-1組中增幅最大，達63.9%。0 mg·kg-1組中加硒對根尖數和平均直徑的影響不明顯，在50、200 mg·kg-1和800 mg·kg-1組中呈顯著性差異（P＜0.05），硒的加入使根尖數分別增多了27.2%、36.4%、59.0%，平均直徑增大了24.9%、25.8%和30.8%。

2.3 硒對不同濃度萘脅迫下植物根部MDA含量、CAT活性及GSH含量的影響

2.3.1 對MDA含量的影響

MDA 的含量可反映植物細胞質膜脂的過氧化水平。如圖3 所示，隨著萘濃度的升高，加硒組與無硒組中植物體內MDA 含量均呈上升趨勢，在800 mg·kg-1濃度達到最大，與無脅迫處理相比分別增大了47.9%和41.1%。硒的添加使得各濃度萘脅迫下車前草根系MDA 含量較無硒組均顯著降低（P＜0.05），減少了植物根部受到的損傷，在50 mg·kg-1和200 mg·kg-1時降幅較大，分別為15.8%和15.0%，此后降幅變緩。

2.3.2 對CAT活性的影響

圖1 硒對萘脅迫下車前草地上部分和根部質量及長度的影響Figure 1 Effects of Se on fresh weight and length of Plantago asiatica L.shoots and roots exposed to naphthalene

圖2 硒對萘脅迫下車前草的根表面積、根體積、根尖數、平均直徑的影響Figure 2 Effect of Se on root area，root volume，root node number and root mean diameter of Plantago asiatica L.grown in naphthalene contaminated soil

圖3 硒對萘脅迫下車前草根部丙二醛含量的影響Figure 3 Effect of Se on malondialdehyde content in Plantago asiatica L.root exposed to different concentrations of naphthalene

CAT是植物體內重要的抗氧化酶，可分解植物受脅迫時產生的過多自由基。由圖4 可知，當萘的添加濃度上升時，車前草中CAT 活性也在不斷增強。當萘的添加量為50 mg·kg-1和200 mg·kg-1時，CAT 活性提高趨勢較緩，較0 mg·kg-1組提高了6.9%和10.0%，在800 mg·kg-1時提高幅度達到最大，為31.0%。與無硒組對比，在0 mg·kg-1和50 mg·kg-1組中硒的添加使CAT 活性增加幅度不明顯，在200 mg·kg-1和800 mg·kg-1濃度時則增幅達到顯著差異水平（P＜0.05）。

圖4 硒對萘脅迫下車前草根部過氧化氫酶活性的影響Figure 4 Effect of Se on catalase activity in Plantago asiatica L.root exposed to different concentrations of naphthalene

2.3.3 對GSH含量的影響

GSH 是植物體內的抗氧化物質，含有活性巰基，對清除由活性氧產生的H2O2有著重要作用。由圖5可知，車前草根系GSH 含量與CAT 活性變化趨勢相似，在萘脅迫下車前草根系GSH 含量隨著萘濃度增大而升高。50 mg·kg-1處理時GSH 含量較0 mg·kg-1組增加幅度不明顯，為12.5%，在200 mg·kg-1和800 mg·kg-1時增加29.2%和48.1%。0 mg·kg-1和50 mg·kg-1處理時，加硒組與無硒組相比GSH 含量增加未達到顯著差異（P＞0.05），此后增幅變大，在200 mg·kg-1處理時為24.2%，800 mg·kg-1組中達到33.4%，差異性均達到顯著水平（P＜0.05）。

2.4 硒對車前草修復土壤中萘的影響

種植60 d 后，土壤中殘留萘的含量見圖6。由圖可知，未種植組與種植組中的土壤萘含量與試驗初始時相比均有所減少，但種植組中萘的殘留量較無植物對照組中明顯降低，種植車前草后，萘的去除率在53.6%～98.6%。其中50 mg·kg-1處理下萘的降解效果最好，加硒組和無硒組中降解率均超過98%。總的來說，土壤中萘的去除率在低含量時較高，隨著萘質量分數的增大，加硒組和無硒組的去除率均呈下降趨勢。此外，加硒后車前草對污染土壤中萘的去除效果優于無硒組，在50、200 mg·kg-1和800 mg·kg-1處理組中分別提高了0.5%、11.6%和6%。

3 討論

植物的生物學性狀能指示其生長環境。本研究發現植物的生物量和長度受到萘含量的抑制，且抑制程度隨萘含量的升高而增大，這與宋宜枝等[24]關于蒼耳的研究結果一致。硒不是植物生長所必需的元素，但作為對植物生長有益的元素，已有研究證明適量濃度硒的添加對植物生長具有刺激作用[25]。試驗結果顯示，向土壤中加入適量的硒在不同程度上增加了車前草地上部分和根部的質量和長度，外源硒的添加能夠減輕萘對車前草生長的毒害作用。

圖5 硒對萘脅迫下車前草根系谷胱甘肽含量的影響Figure 5 Effect of Se on glutathione content in Plantago asiatica L.root exposed to different concentrations of naphthalene

圖6 硒對不同濃度處理組萘殘留量和去除率的影響Figure 6 Effect of Se on the residual naphthalene in soil and removal ratio of Plantago asiatica L.at different concentrations of naphthalene

根系作為提供水分和養分的重要器官，是最早感知逆環境脅迫的部位，根系形態的改變是植物維持養分吸收的重要應激反應，與植物生長密切相關[26]。因此，根系形態直觀地反映了植物對逆環境的適應能力[27]。本試驗中根表面積、體積、根尖數和平均直徑隨著萘添加濃度的升高依次降低，通過向土壤中添加亞硒酸鹽，車前草各項根系形態學指標在50、200、800 mg·kg-1時均顯著增加（P＜0.05）。可見萘抑制了車前草根系的生長發育，但外源硒的添加能夠在一定程度上緩解萘的毒害效應，改善根系對養分和水分的吸收利用，對植株生長發育起到積極作用，使植物更好地適應環境。

MDA 是植物膜脂過氧化物，常作為細胞膜受損害程度的衡量指標[28]。在本研究中，車前草受到萘脅迫后，其細胞膜透性增加，MDA 含量隨著萘濃度的增加而上升，硒的加入顯著減少了植物體內MDA 含量（P＜0.05），表明硒能緩解萘脅迫下植株體內MDA 的累積，具有減輕氧化應激和保護脂質膜的作用[29]。當植物受到外界環境脅迫時會產生活性氧成分，導致細胞膜結構及功能的變化，對植株造成不利影響。為保護自身免受環境傷害，植物以ROS 為信號刺激產生大量抗氧化物質。植物抵抗ROS 的系統分為兩類：一類是小分子物質，如還原型谷胱甘肽、胡蘿卜素、抗壞血酸等；另一類是抗氧化酶，如過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等[30]。土壤萘污染對車前草產生脅迫時會引起活性氧的大量積累，對植物細胞造成氧化損傷。為減輕或消除細胞損傷，植物體內的酶保護系統和非酶抗氧化劑啟動保護機制，表現為車前草根系的GSH 含量和CAT 活性呈增加趨勢。在外源硒的作用下，相同濃度萘脅迫下（200 mg·kg-1和800 mg·kg-1）加硒組中抗氧化物質含量和抗氧化酶活性較無硒組顯著增大（P＜0.05），表明硒的加入有效提高了車前草根系內源保護系統的抵抗能力，這一趨勢與張彩虹等[31]研究結果一致。Tedeschini 等[32]研究也表明，硒對抗氧化能力具有積極作用，能提高活性氧的清除。

萘的殘留量均隨初始添加含量增大而呈上升趨勢。由于揮發、淋溶、光解的作用，無植物組中萘的含量有所下降[33]，外源硒的添加對無植物土壤中萘的殘留量影響不顯著。最大降解率出現在50 mg·kg-1組中，可能因為萘是多環芳烴中苯環最少、最易揮發和光解的一種，且該濃度下萘對車前草的脅迫作用較其他濃度組小，利于植物修復。硒的加入提高了植物對土壤多環芳烴污染的去除率，在200、800 mg·kg-1組中去除率分別上升了11.6%和6.0%。已有研究表明，植物根系越發達，為植物生長提供的營養和水分就越充足，為生命過程提供的能量就越多，越能夠合成抗氧化酶及抗氧化分子，修復活性氧損傷[34]。根系不僅對植物生長起到至關重要的作用，其分泌物和脫落物能夠影響微生物的數量結構和土壤酶活性，從而影響烴類物質的降解[35]。植物可以通過釋放單糖、氨基酸和黃酮類化合物等根系分泌物來加速生物修復[36]，但滲出液受環境因素的影響較大，且明顯受氧化應激的抑制[37]。硒通過減輕根部受到的逆境抑制、增強根的耐受性、促進根系分泌物的釋放來提高植物對污染物的去除[38]。本研究中，同一污染水平下，加硒處理中土壤萘殘留濃度均低于無硒組，硒的添加明顯促進了植物對土壤中萘的修復，這可能是由于硒增強了植物的內源保護機制，根系生長發育得到保護，根表面積顯著增大（P＜0.05），污染物與根的接觸面積得以增大，一方面增加植物對污染物的吸收，另一方面促進了根系分泌物的釋放，提高根際土壤中微生物和酶的活性，從而強化了有機污染物的降解[39]。

4 結論

（1）萘對車前草地上部分和根部質量、長度以及根系形態的脅迫隨萘在土壤中的含量增大而增加，硒的加入一定程度上緩解了萘對植物各項生物學性狀的抑制作用。

（2）各濃度萘處理下，加硒組和無硒組中植物細胞膜均受到脂質過氧化損傷，加硒組中車前草體內抗氧化酶（CAT）活性和抗氧化物質（GSH）含量高于無硒組，硒的作用在于增強植物的內源保護能力，減輕逆環境下活性氧對植物細胞的傷害。

（3）在不同萘污染濃度下添加硒均使土壤中萘的降解率顯著提升，最高可達11.6%。硒通過提高植物的抗逆性來增強植物對土壤中多環芳烴的修復能力。