添加金屬（氫）氧化物對木質素腐殖化作用的影響機理

王 楠，王 帥，徐俊平，王 語，竇 森

（1.吉林農業科技學院農學院，吉林 吉林132101；2.吉林農業大學資源與環境學院，長春130118）

作為自然界中含量僅次于纖維素且有著三維結構的高分子聚合物，木質素占生物質木質纖維成分的10%～30%[1]，是植物骨架結構的重要組分，因其結構復雜、不易分解，在植物細胞壁中纏繞纖維素和半纖維素而生，所以對兩者具有抵御微生物分解的保護作用[2]。而在堆肥過程中，木質素難降解的特性就成為堆肥腐解進程的限速因子。

土壤腐殖質（HS）形成與木質素降解關系密切[3]，而微生物又是影響HS形成的直接驅動因素[4]，由此可作出假設：微生物+木質素=HS。然而，在遠古時代，地球陸地表面由各類巖石組成，HS 的最初形成無法擺脫礦物的參與，在此過程，礦物與微生物間的交互作用是塑造巖石圈、形成土壤的關鍵[5]，即“微生物+木質素+礦物=HS”的科學假設更符合客觀規律。作為土壤學世界領域的科學難題，HS 分子結構異質性不僅決定于有機碳源性質、微生物群落結構，而且還與環境介質有關，而礦物組成作為最重要的環境介質，其所發揮的非生物作用在HS 形成中不可或缺。化學催化聚合學說認為，木質素的分解產物，如酚、醌和脂類化合物能夠在黏土礦物表面吸附的Fe、Al 氧化物的催化下與氨基酸聚合形成HS[6]。Tan[7]指出，梭菌、芽孢桿菌和放線菌等有益微生物菌群能夠在堆肥加熱和嗜熱階段分解和轉化有機物質，產生HS 的前體物質并最終聚合形成HS，在此過程，礦物能夠催化氨基酸、糖和酚等前體物質間的縮聚反應[8]。Fe 或Al的（氫）氧化物是土壤正電荷的主要貢獻者，土壤有機碳（SOC）的積累和穩定在很大程度上決定于Fe 或Al（氫）氧化物對水溶性有機物（DOM）的吸附[9]。有報道指出[10]，土壤有機質（SOM）含量通常與Fe、Al（氫）氧化物含量成正比。針鐵礦能夠吸附并穩定有機物質、抑制微生物的分解[11]。在北極土壤中，氧化還原界面富集的鐵能夠通過吸附DOM、與顆粒狀有機物聚集、不溶性Fe（Ⅱ）與Fe（Ⅲ）-有機復合物的凝聚等多種機制阻礙有機物質的降解[12]。無定形氫氧化鋁能夠較強烈地吸附DOM，并通過保護機制使DOM 免受土壤微生物的分解[13]。Miltner 等[14]研究指出，Fe 或Al（氫）氧化物能夠通過吸附木質素或其氧化的副產物抑制木質素的分解。此外，錳氧化物也是土壤氧化還原過程的主要參與者，對土壤生態系統中HS-酶復合物的形成有促進作用[15]，尤其在Maillard 反應中，δ-MnO2更是充當氧化劑來促進暗色物質的形成。在Fe、Al、Mn 氧化物催化加速腐殖化進程方面，人工合成的Mn（Ⅳ）-氧化物＞Fe（Ⅲ）-氧化物＞Al-氧化物＞Si-氧化物[16]，而在提高總腐殖質聚合物產量方面[17-18]，Fe（Ⅲ）-氧化物＞Mn（Ⅳ）-氧化物＞Al-氧化物＞Si-氧化物＞無催化劑。Wu 等[19]研究認為，在玉米秸稈堆肥中，MnO2的添加可在5 d 內迅速降低還原糖的濃度并相應提高HS 的含量。Yuan 等[20]研究表明，堆肥中Fe（Ⅲ）氧化物的減少可相應提高胡敏酸中可提取醌類和芳香碳的含量。

綜上，以往研究多關注添加氧化物后HS 組分及結構特性的變化，以此來探究氧化物的催化作用，對于相關機理的闡述稍顯不足。鑒于此，本研究采用液體搖瓶培養法，以木質素為碳源，通過混合菌株懸液的接種，針鐵礦、三羥鋁石及δ-MnO2的添加，對培養110 d 期間收集的含有氧化物的沉淀物質，用H2O2淋洗去除有機分子，應用SEM、FTIR 和X 射線衍射技術，以Fe、Al、Mn 的（氫）氧化物為第一視角，分析結構特征變化，以此揭示其在HS 形成過程中的非生物催化機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木質素（CAS No [9005-53-2]）購于東京化成工業株式會社；針鐵礦、三羥鋁石和δ-MnO2制備方法如下[11]：針鐵礦，稱取Fe（NO3）3·9H2O 50 g于廣口塑料瓶中，加入825 mL 蒸餾水使之溶解，在不斷攪拌下緩慢滴加2.5 mol·L-1NaOH溶液至懸液pH 11.9，60 ℃陳化48 h；δ-MnO2，取180 g MnSO4·H2O 溶解到1500 mL 29 mmol·L-1的H2SO4溶液中，另取120 g KMnO4溶于1500 mL 蒸餾水中，邊攪拌邊將該溶液緩慢加入到MnSO4溶液中；三羥鋁石，將0.18 mol·L-1的KOH 溶液以3 mL·min-1的速度滴加到0.06 mol·L-1Al（NO3）3溶液中，并不斷攪拌，直到懸液pH 9.0，室溫下老化30 d。上述氧化物經去離子水多次洗滌至洗液近中性，經半透膜滲析后于60 ℃下烘干并磨細過0.25 mm篩，備用。

復合菌株由4種細菌[枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）和地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）]、2 種放線菌[灰色鏈霉菌（S.griseus）和細黃鏈霉菌（S.microflavus）]和3 種真菌[綠色木霉（T.viride）、黑曲霉（A. niger）和桔青霉（P.citrinum）]組成，將9 種單一菌株懸液等體積摻混制成復合菌株懸液，懸液中各菌落數如下：B.subtilis、B.megaterium、B.pumilus、B.licheniformis、S.griseus和S.citrinum分別為5.9×106、2.6×106、7.2×106、4.4×106、6.0×109cfu·mL-1和4.2×109cfu·mL-1，T.viride、A.niger和P.citrinum孢子數分別為201、68 cfu·mL-1和158 cfu·mL-1。

1.2 試驗設計

采用液體搖瓶培養法，培養液配方參照察氏培養基進行，由木質素提供碳源，具體配方如下：NaNO32.0 g、K2HPO41.0 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、木質素1.0 g、水1000 mL，無需調節pH。

為了探索Fe、Al、Mn的（氫）氧化物在木質素腐殖化作用中的催化機理，試驗共設3 個系列處理：針鐵礦（Goethite）用G 表示，三羥鋁石（Bayerite）用B 表示，δ-MnO2用Md 表示。復合菌株懸液的接種體積按300 mL培養液接種20 mL進行，接種后，塞好棉塞，用報紙包扎好，在28 ℃恒溫條件下搖瓶（180～200 r·min-1）培養110 d，期間按10、30、60、110 d 動態取樣，分別用G-10、G-30、G-60、G-110，B-10、B-30、B-60、B-110 和Md-10、Md-30、Md-60、Md-110 表示，取樣后立即離心（12 000 r·min-1，10 min），收集含有氧化物的沉淀物質。另外同時設置2 個培養110 d 后的對照處理，用G-110-CK2、B-110-CK2 和Md-110-CK2表示不接種復合菌株懸液，僅在木質素培養液中添加針鐵礦、三羥鋁石或δ-MnO2的情況；用G-110-CK3、B-110-CK3和Md-110-CK3表示在缺失木質素，添加針鐵礦、三羥鋁石或δ-MnO2的培養液中，僅接種復合菌株懸液的情況，待110 d培養結束后立即離心，收集沉淀物質。將上述沉淀物質放入60 ℃鼓風干燥箱中烘至恒質量、磨細過0.25 mm 篩。針鐵礦、三羥鋁石和δ-MnO2的原樣品用G-sample、B-sample 和Mdsample 表示。用30%優級純H2O2對上述沉淀物質及氧化物原樣品進行淋洗處理，去除氧化物表面的有機成分，再用去離子水多次洗滌，直至洗液中無有機成分，置入60 ℃鼓風干燥箱中烘至恒質量、粉碎過0.25 mm 篩，待檢。

1.3 分析方法

SEM（Scanning electron microscopy）。采用SS550型掃描電子顯微鏡（日本島津儀器公司）對氧化物樣品進行表面微觀形貌觀察，測試條件為15.00 kV，分辨率為6 nm。

FTIR（Fourier transform infrared spectra）。將氧化物樣品與光譜純KBr 1∶100 混合、研磨、壓片，利用FTIR-850 傅立葉變換紅外光譜儀（天津港東科技發展股份有限公司）對樣品進行FTIR測試：掃描次數32次，分辨率4 cm-1，Y軸格式為透過率，切趾方式為Triangle，每次采集樣品前采集背景并扣除。

XRD（X-ray diffraction）。采用德國bruker粉末X射線衍射儀（D8 FOCUS 型）對氧化物樣品進行檢測，測試條件為CuKα 射線，Ni 濾波，40 kV，40 mA，Lynx-Eye192位陣列探測器，掃描步長0.01°（2θ），掃描速度每步0.05秒，λ=1.540 598 ?。

2 結果與討論

2.1 Fe、Al、Mn 的（氫）氧化物參與木質素腐殖化作用前后的SEM圖像

如圖1a 所示，針鐵礦樣品呈絨球狀結構，表面有細絲狀物質，顆粒大小不一，排列松散，較大顆粒長徑約15 μm，參與木質素腐殖化作用后（圖1b），形貌特征無明顯變化，小顆粒比例增加且顆粒邊緣棱角更加分明，大多數顆粒直徑小于10 μm，晶體結構中出現大量納米孔隙，這與結構水的脫除有關。由圖1c 可見，三羥鋁石大多呈多邊形顆粒狀結構，不規則的晶體排布有著不均勻的尺寸分布，除了結晶相之外，還可以看到具有混合形態的小顆粒，這表明存在無定形或弱結晶的Al（OH）3，這與Kupcik 等[21]的表述一致。此外，顆粒大小較均勻，直徑均在1 μm 以下。Tsuchida等[22]指出，三羥鋁石具有近似于六邊形最密堆積的羥基晶格結構。而參與木質素轉化后（圖1d），晶粒輪廓更加清晰，粒徑更小，部分顆粒有聚集趨勢，晶粒間孔隙增多。由圖1e 可知，作為一種二維層狀結構的納米金屬氧化物，δ-MnO2為無定型、不規則的球狀顆粒，或稱類球形粒子，顆粒直徑小于0.3 μm，有較強的簇擁或凝聚態勢[23]，每一個球狀顆粒可視為多孔的微納米球，或稱MnO2晶胞。參與木質素轉化后（圖1f），顆粒結合更加松散且空穴增加，微納米球邊緣更加清晰，這與MnO2表面結合水的脫去有關。

2.2 Fe、Al、Mn 的（氫）氧化物參與木質素腐殖化作用的FTIR光譜

如圖2a 所示，3402～3421 cm-1歸屬針鐵礦H-OH 和O-H 的伸縮振動，3130～3163 cm-1為結構OH 的伸縮振動，1626～1633 cm-1為水分子的彎曲振動[24]，893 cm-1和795 cm-1歸屬Fe-OH 平面內與平面外的彎曲振動（δOH和γOH）[25]，638 cm-1為Fe-O 的伸縮振動。結合表1，與對照（G-110-CK2 和G-110-CK3）相比，針鐵礦參與木質素腐殖化作用后可有效降低其表面O-H 的伸縮振動，同時增加了水分子的彎曲振動頻率。在此過程中，木質素分子及接種的復合菌株通過配體交換過程吸附于針鐵礦，來自其羧酸基團的質子與針鐵礦表面羥基反應形成水[26]，使得針鐵礦表面的結構羥基向水合基轉變。與G-10 相比，G-30、G-60和G-110處理的結構OH伸縮振動、水分子彎曲振動、Fe-OH 彎曲振動及Fe-O 伸縮振動均有不同程度增強。這表明，木質素分子及接種的復合菌株在培養過程中均可與針鐵礦表面水合羥基之間形成電荷-偶極鍵，并以氫鍵形式結合[25]，使針鐵礦表面水合羥基（-OH+2）及結晶水O-H 的締合程度增高。此外，針鐵礦通過表面游離羥基與復合菌株以配體交換方式締結，菌體表面含氧陰離子與針鐵礦表面活性基團發生了相互作用，隨培養延續，Fe-OH 發生質子化，H+進入溶液，使Fe-O 鍵有所增強[26]。可見，配體交換和氫鍵是針鐵礦催化木質素腐殖化作用的主要機制。

如圖2b 所示，3656、3550、3463 cm-1和3435 cm-1為三羥鋁石α-Al（OH）3表面OH 的伸縮振動，1630～1639 cm-1代表未與Al3+配位鍵合的自由分子水，1043 cm-1和980 cm-1為O-H 的彎曲振動，多由Al-OH 的振動產生，777、536 cm-1也屬三羥鋁石的典型吸收峰[27]，分別對應AlO4四面體中Al-O的不對稱伸縮振動以及AlO6八面體中Al-O 的伸縮振動。結合表1 可見，與B-10 相比，參與木質素轉化后的三羥鋁石（B-30、B-60 和B-110），其表面來自O-H 彎曲振動的羥基（Al-OH）能以化學氫鍵形式與微生物轉化的木質素結合，增加了水合基的振動頻率，同時部分OH 基團被來自微生物及其轉化木質素的羧基所取代，弱化了Al-O鍵[28]，即降低了AlO4四面體和AlO6八面體中的Al-O伸縮振動。可見三羥鋁石Al-OH 和Al-O 鍵參與了木質素的腐殖化作用，水分子橋鍵及螯合物的形成使Al-OH+2的振動頻率增強[29]。

圖2 針鐵礦、三羥鋁石及δ-MnO2參與木質素腐殖化作用的FTIR光譜Figure 2 FTIR spectra of goethite，bayerite and δ-MnO2 involved in lignin humification

由圖2c可知，3403～3423 cm-1為δ-MnO2表面-OH的伸縮振動，1626～1633 cm-1歸屬結晶水H-O-H 的彎曲振動，1043 cm-1歸屬Mn-OH 的振動，534～544 cm-1為MnO2中Mn-O 的彎曲振動[23]。結合表1 可知，與對照（Md-110-CK2 和Md-110-CK3）相比，參與木質素微生物轉化的δ-MnO2表面吸附水的O-H 振動頻率有所減弱，說明經微生物轉化的木質素分子與δ-MnO2表面羥基發生了締合，形成了外圈配合物[30]。與Md-10相比，Md-30、Md-60和Md-110處理下的δ-MnO2表面結晶水數量減少，相反增加了O-Mn-O 鍵的振動頻率，結晶水的減少可以用錳氧化物吸附天然有機質的疏水作用來解釋[31]，而Md-10 處理下δ-MnO2結構中Mn-OH 鍵的振動頻率最為強烈，而后因MnO2表面O-H與微生物轉化木質素的含氧陰離子締結，使得去質子化趨勢明顯，從而破壞了MnO2表面OH 結構，使Mn-OH 中的O-H 解離生成Mn-O 而使1043～1047 cm-1處吸收峰強度減弱，同時增強了534～544 cm-1處吸收峰的強度[26]。

表1 針鐵礦、三羥鋁石和δ-MnO2參與木質素腐殖化作用FTIR光譜主要吸收峰的相對強度（半定量）Table 1 Main absorption peaks′ relative intensities from FTIR spectra of goethite，bayerite and δ-MnO2 during their participations in lignin humification（semi-quantitaty）

2.3 Fe、Al、Mn 的（氫）氧化物參與木質素腐殖化作用的XRD譜圖

如圖3a 和表2 所示，2θ 在21.2°、33.3°、36.7°、53.2°和59.1°處均為針鐵礦的特征衍射峰（JCPDS 74-2195），峰形較窄，說明針鐵礦樣品結晶度較高且在參與木質素轉化后，其單體結晶度仍處于良好狀態。此外，2θ 在這5 處特征衍射峰下的d 值（晶面間距）分別處于4.14～4.19、2.68～2.69、2.44～2.45、1.71～1.72 nm 和1.56 nm，可推斷，針鐵礦在參與木質素腐殖化作用前后衍射角2θ和晶面間距d僅發生了較小偏移，并未發生物相轉變。

如圖3b，三羥鋁石XRD 譜圖與Wei 等[27]的報道相似，對應Al（OH）3（JCPDS Card No. 12-0457），2θ 在27.9°、38.2°和64.5°的位置出現了分別對應立方結構勃姆石[γ-AlOOH]的（120）、（140）以及（231）晶面的衍射峰，同時也在2θ 為18.9°和20.4°位置上出現了分別對應拜耳石[α-Al（OH）3]的（001）和（110）晶面的（最強、次強）衍射峰。結合表2 可知，僅在培養110 d收集的三羥鋁石（B-110）2θ 在19.0°、20.6°、28.0°、38.4°和64.5°的峰位向高波方向偏移了0.1°～0.2°，其他處理下的晶面衍射峰位和晶面間距均未發生明顯改變，表明三羥鋁石參與微生物轉化木質素后也未發生物相變化。

由圖3c 和表2 可知，δ-MnO2在2θ 為13.2°、36.6°和65.2°三處存在明顯衍射峰，且均為典型δ-MnO2的衍射峰，對應δ-MnO2（JCPDS 80-1098）的（001）、（-111）和（-321）晶面[23]。而在參與木質素轉化后，δ-MnO2系列樣品的衍射峰分別在12.0～12.6°、36.6～37.4°和65.8～66.5°出現，衍射峰明顯寬化，表明δ-MnO2的晶型結構不完整、結晶度不高。與δ-MnO2原樣品相比，參與轉化的δ-MnO2僅在低波處衍射峰位發生了改變，由13.2°降至12.0°～12.6°，其他衍射角2θ和晶面間距d均未發生明顯變化。

3 結論

（1）針鐵礦參與木質素腐殖化作用后，形貌特征無明顯變化，晶體結構中出現的納米孔隙與結構水的脫除有關，其表面水合羥基可與微生物及其轉化的木質素間形成電荷-偶極鍵，使表面水合羥基（-OH+2）及結晶水O-H 的締合程度增強。隨培養進行，Fe-OH發生質子化，使Fe-O的振動頻率有所增強，配體交換和氫鍵作用在此起主導作用。

圖3 針鐵礦、三羥鋁石和δ-MnO2參與木質素腐殖化作用的XRD譜圖Figure 3 XRD spectra of goethite，bayerite and δ-MnO2 involved in lignin humification

（2）三羥鋁石參與木質素腐殖化作用后，晶粒輪廓更加清晰，部分顆粒有聚集趨勢，其表面Al-OH 能以氫鍵形式與微生物及其轉化的木質素結合，增加了水合基的振動頻率，同時部分OH 基團還可被微生物及其轉化木質素的羧基所取代，弱化了Al-O鍵，降低了AlO4四面體和AlO6八面體中Al-O 的伸縮振動，水橋鍵及螯合物的形成使Al-OH+2的振動頻率增強。

表2 針鐵礦、三羥鋁石和δ-MnO2參與木質素轉化過程XRD特征衍射峰的晶面間距Table 2 Interplanar spacing of XRD spectra diffraction peaks of goethite，bayerite and δ-MnO2 involved in lignin transformation

（3）δ-MnO2通過疏水作用參與木質素微生物轉化后，顆粒結合更加松散且空穴數量增加，微納米球邊緣銳化，表面結晶水有脫除趨勢，相應增加了OMn-O 鍵的振動頻率，此外，Mn-OH 的去質子化也使該趨勢更加明顯。

（4）Fe、Al、Mn 的（氫）氧化物均是通過表面羥基與金屬含氧基團來催化木質素的腐殖化作用，其本身并未發生物相改變。