磷礦區高效解磷菌的分離鑒定及其堿性磷酸酶的克隆表達

寧 清，劉 迪，靳 翔，弓亞杰，薛智權，呂建華

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

山西省是礦產資源大省，為國家經濟發展作出了不可估量的貢獻，但礦產資源開發的同時也使農業生態環境遭受到了非常嚴重的破壞。山西省還是全國中藥材的主采區之一，是中藥資源大省。而在采礦復墾區種植中藥材既能改善復墾區土壤生態系統，也可為當地經濟發展帶來推動力。農業生產的重要物質保障離不開磷，它是植物生長發育中最主要的營養元素之一[1]。然而，礦區復墾土壤因為嚴重缺乏可溶性磷，造成養分含量降低、微生物數量減少、溶磷活力低下、土壤貧瘠[2-3]，導致作物生長緩慢，產量低，質量差。為了滿足作物對土壤磷元素的需求，提高作物產量，農民大量施用化學磷肥，但施入磷肥的成本高、有效轉化效率過低、浪費嚴重；同時化學肥料的過度施用會對土壤和水體環境造成嚴重的污染[4]，而且肥料中70% 以上的水溶性磷會與土壤中的Fe3+、Al3+、Ca2+等結合，生成非常難溶的磷酸鹽沉淀。生物固定化和其他反應會很快耗盡可用的磷酸供應，留下極少部分供給植物[5-6]。因此，釋放土壤中固定化的磷可以增加土壤中磷元素的生物利用度。

土壤微生物在磷循環中起著至關重要的作用，其中，一些細菌可以通過溶解不溶性磷酸鹽來提高植物的有效磷庫，其被稱之為解磷菌。目前報道，較多的解磷菌主要包括芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、無色桿菌屬（Achromobacter）、固氮菌（Azotobacter）、農桿菌（Agrobacterium）、微球菌（Micrococcus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、根瘤菌（Rhizobium sp.）等[7-8]。這些溶磷微生物能夠通過分泌有機酸、無機酸、嗜鐵素、H2S、腐殖質、磷酸酶、胞外多糖等物質或NH4+同化作用將土壤中無效磷轉化為植物可以充分利用的有效磷，提升磷肥利用率，改善土壤結構，促進作物生長[5，9]。目前，已有將解磷菌應用于玉米、青菜、小麥、大麥、油菜等作物種植，并取得了較好的效果[3，10-13]。另外，王樣庭等[14]從中藥材牛蒡的根際土壤中也分離得到了活性較高的溶磷菌株。因此，解磷菌在促進中藥材生長等方面也具有潛在的應用價值。

本研究從山西祁縣磷肥廠磷礦石堆積區和排污口收集土壤樣品，利用選擇培養基從樣品中篩選具有解磷活性的菌株，并通過分離、純化、復篩，得到1 株具有高解磷活性的菌株SXAU- S1；結合形態學觀察、生理生化特征研究和16S rDNA 序列的方法對該菌株進行了鑒定，另外還克隆并表達了該菌株的堿性磷酸酶基因，旨在了解該菌株的解磷能力，為開發新的廉價、高效且環境友好的微生物菌肥提供科學依據，對加快復墾區土壤生態修復、提高復墾區種植作物的質量和產量具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土壤 土壤樣品采集自山西省祁縣磷肥廠的磷礦石堆積區和排污口。采集方法為3 點采樣法，去除表層土，用滅菌后的鏟子挖取深度5～20 cm 的土壤，去除石塊后，將3 個不同點的土壤樣品混合成一份，裝入50 mL 無菌離心管中，標記好采樣信息，放入4 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 篩選培養基NBRIP[15]葡萄糖10 g，磷酸鈣5 g，六水氯化鎂5 g，七水硫酸鎂0.25 g，氯化鉀0.2 g，硫酸銨0.1 g，瓊脂15 g，去離子水1.0 L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2 富集培養基LB 液體培養基 酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，去離子水1.0 L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.3 優化培養基 在1.1.2.1 的NBRIP 培養基的基礎上，分別將葡萄糖（10 g）替換為甘油10.23 g、蔗糖9.5 g、乳糖9.5 g，或是分別將硫酸銨（0.1 g）替換為尿素0.04 g、氯化銨0.08 g、硝酸鉀0.15 g。

1.1.3 其他試劑 試驗所用其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 解磷菌的分離與初篩 將不同的土壤樣品各稱取10 g 分裝到三角瓶中，加入50 mL 雙蒸水，富集一晚上；第2 天將其靜置20 min，用移液槍吸取上層100 μL 到固體篩選培養基平板上，涂布后在28 ℃進行培養；5 d 后觀察，挑取具有較大溶磷透明圈的菌株，接種到篩選培養基上進行劃線培養，重復試驗直到出現單克隆菌株透明圈為止；接種到富集培養基中搖床培養（220 r/min，28 ℃），24 h后，菌株生長濃度達到要求，取200 μL 菌液和200 μL 甘油保存并標記。

1.2.2 解磷菌鑒定

1.2.2.1 菌株的形態學觀察 吸取少許新鮮菌加入生理鹽水稀釋，在酒精燈上方搖動干燥，用結晶紫初染1～2 min，水洗；晾干后再取碘液復染1 min，水洗，95%乙醇脫色20 s，水洗，番紅復染2 min，水洗晾干，在高倍顯微鏡下觀察。

1.2.2.2 菌株的分類學鑒定 試驗以所得菌株的總DNA 為模板進行16S rDNA 擴增，通過對其序列比對以確定菌株的種屬?？侱NA 提取采用細菌基因組DNA 提取試劑盒（康為世紀公司，北京）提取，操作步驟按照說明書進行。所用引物為細菌16S 序列擴增通用引物27F（5′- AGAGTTTGATCATGGCT CAG- 3′）和1492R（5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR 反應體系（50 μL）：5 μL10 × buffer，2 μL dNTP，2 μL 27F，2 μL 1492R，2 μL 基因組DNA，1 μL Taq DNA 聚合酶，36 μL ddH2O。PCR 反應條件為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s ，共35 個循環；最后在72 ℃延伸5 min。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，然后將PCR 產物送到北京華大基因有限公司進行直接測序。采用Blast 軟件對所得序列在GenBank 數據庫里進行比對，根據同源性確定其種屬。

1.2.3 解磷菌生長條件優化

1.2.3.1 碳源和氮源的影響 分別以蔗糖、乳糖、甘油、葡萄糖為篩選培養基中唯一碳源，其培養條件不變，按1%的接種量接種菌株S1，于28 ℃、220 r/min 振蕩培養24 h，以不接菌為對照組，每個處理重復3 次，取上清液用酶標板測定600 nm 處的吸光度。同理以尿素、氯化銨、硝酸鉀為唯一氮源替換等量氮元素含量的硫酸銨，從而研究不同碳氮源對菌株生長濃度的影響。發酵液解磷活性測定采用鉬銻抗法[16]。

1.2.3.2 培養條件優化 根據1.2.3.1 的試驗結果，確定最佳的碳源和氮源，采用L16（44）正交試驗設計進一步優化S1 的生長條件，以不接菌為對照，重復3 次，試驗設計如表1 所示。

表1 培養條件優化試驗各因素和水平設置

1.2.4 菌株堿性磷酸酶基因的克隆和表達

1.2.4.1 菌株堿性磷酸酶基因的克隆 根據1.2.2的結果，在GenBank 數據庫中搜索成團泛生菌Pantoea agglomerans 的堿性磷酸酶基因序列（JYGW 01000006.1：39510- 40523），以此為參照設計擴增引物C6- AKP- F（5- CCGGAATTCGATGTTTTATTCCCTCCG- 3）和C6- AKP- R（5- CCGCTCGAGCACTT TGGGATTGGTCAG- 3），其中，上游引物劃線部分為EcoR I 酶切位點，下游引物劃線部分為Xho I 酶切位點。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，并采用凝膠回收試劑盒（TransGen，北京）對目的條帶進行回收。回收產物與pBackZero T Vector（Takara，大連） 連接后轉化進Escherichia coli DH5α 感受態細胞，挑取單克隆，采用基因特異性引物PCR 擴增確定插入片段后，將陽性克隆送去測序。

1.2.4.2 菌株堿性磷酸酶基因的表達 將經測序驗證序列正確的重組質粒進行EcoR I＋Xho I 雙酶切，與相同雙酶切后的pET22b 表達質粒連接，構成表達重組質粒，并轉入到Escherichia coli BL21 表達宿主菌中。挑取單克隆接種到含有氨芐的液體LB 培養基中，37 ℃200 r/min 培養，待菌液的OD600值到0.8 左右時，加入終濃度1 mmol/L 的IPTG，16 ℃200 r/min 誘導培養6 h，離心收集菌體，懸浮于磷酸緩沖液中，超聲破碎后，12 000 r/min 離心10 min，留取上清。采用考馬斯亮藍G250 染色法測定蛋白濃度，采用SDS- PAGE 和考馬斯亮藍R250 染色法觀察裂解液中蛋白的表達情況。收集2 mL 發酵液的菌體，用500 μL PBS 懸浮，超聲裂解后離心，收集上清，取50 μL 裂解液加入到NBRIP 液體中，28 ℃反應30 min 后，測定溶液中有效磷的含量，即為重組菌裂解液堿性磷酸酶的活性。

2 結果與分析

2.1 高效解磷菌的分離與純化

本試驗采用以磷酸鈣為唯一磷源的NBRIP 培養平板對菌株進行初步篩選，具有解磷活性的菌株能夠分解培養基中的磷酸鈣，形成透明圈，結果如圖1 所示，通過初篩分離出單克隆11 株解磷菌，編號為SXAU- S1～SXAU- S11；選擇透明圈大、生長狀況良好的菌株SXAU- S1 進行后續研究。

2.2 解磷菌鑒定

挑取SXAU- S1 單克隆進一步純化后，采用LB液體培養基進行富集培養，然后吸取菌液進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察結果如圖2 所示，可見菌體為革蘭氏陰性球菌，菌體直徑約0.5～1.0 μm，液體培養狀態下呈彌散分布。

提取菌株基因組DNA，電泳結果如圖3- A 所示，結果顯示，總DNA 含量較少且有部分降解，可能是由菌體裂解時間過長所致。以基因組DNA 為模板，擴增16S rDNA 序列，電泳結果如圖3- B 所示，結果顯示，在1 500 bp 附近有單一的條帶，符合預期設計大小。

對菌株SXAU- S1 的16S rDNA 擴增片段進行測序，將得到的序列提交到GenBank 數據庫中，序列ID 為MK875137。在GenBank 數據庫進行比對，并與相近的序列構建進化樹，結果如圖4 所示，該序列與Pantoea agglomerans strain 48b/90 的16S rRNA 序列（Sequence ID: FJ756354.1）在分類學上位置最接近。結合形態特征，依據《常見細菌系統鑒定手冊》，確定該菌株為Pantoea agglomerans，命名為Pantoea agglomerans strain SXAU- S1。

2.3 不同培養基成分對菌株SXAU-S1 生長的影響

2.3.1 不同碳源對菌株生長狀況的影響 菌株SXAU- S1 在不同碳源的液體培養基中培養過夜，測得的菌體濃度值如圖5 所示。由圖5 可知，菌株SXAU- S1 在不同碳源培養基中生長狀態存在差異，OD600的測定值大小依次為甘油＞葡萄糖＞蔗糖＞乳糖。以甘油為唯一碳源時，過夜培養的SXAU- S1發酵液達到0.685，顯著高于乳糖（P＜0.01）；也高于以蔗糖和葡萄糖作碳源的培養基，但沒達到統計學差異?？赡苁怯捎谠摼暝谏L過程中，優先利用低碳化合物，而乳糖代謝途徑比較復雜，菌株SXAU- S1 不能很好地利用乳糖。

2.3.2 不同氮源對菌株生長狀況的影響 由圖5可知，菌株SXAU- S1 在氯化銨、硝酸鉀和硫酸銨培養基中生長速度差不多，但都比在尿素液體培養基中生長狀況要好?？赡苁怯捎诰闟XAU- S1 在生長過程中利用無機氮的效率要大于有機氮。

2.3.3 其他培養條件的優化 根據碳源和氮源的試驗結果，確定培養基中碳源選用甘油，氮源選用氯化銨，設計4 因素4 水平正交試驗，進一步考察培養基pH 值和溫度對菌體生長的影響，結果列于表2，根據K 值和R 值可知，4 個因素對菌株SXAU- S1 生長的影響大小順序為氯化銨＞PH＞T＞甘油。正交試驗初步得到，在接種量為1%時，最優條件為氯化銨0.4 g/L、pH 值為9、T 為33 ℃、甘油為10 g/L。

表2 菌株SXAU-S1 培養條件優化的正交試驗結果

根據正交試驗結果，選擇最優培養條件，培養72 h 后，測定發酵液中有效磷的含量和pH 值，結果顯示，發酵液中有效磷含量最高達到了287.48 mg/L，而發酵液的pH 值降低到3.67。

2.4 菌株SXAU-S1 堿性磷酸酶基因的克隆與表達

2.4.1 SXAU- S1 菌株堿性磷酸酶基因的克隆 以SXAU- S1 基因組DNA 為模板，以堿性磷酸酶特異性引物C6- AKP- F/R 進行擴增，PCR 產物的瓊脂糖電泳結果如圖6- A 所示，結果顯示，在1 000 bp 附近有單一條帶。將該條帶切膠回收后，與T 載體相連接構成重組克隆質粒T- akp，轉化進Escherichia coli DH5α，挑取陽性克隆進行測序。對得到的序列進行分析，所得序列長度為1 014 bp，是一個包含起始密碼和終止密碼的完整開放閱讀框。經Blast比對，結果發現，該序列與Pantoea agglomerans strain L15 的aminopeptidase 基因（Accession No.：CP034148）具有99%的相似度，二者的開放閱讀框長度一致，但是編碼區有5 個堿基不同，分別為52（T- G）、110 （T- C）、388 （C- T）、487 （C- T）、1 000（T- C）。進一步將二者的編碼序列翻譯成蛋白質序列進行比較，結果顯示，完全一致，揭示堿性磷酸酶在該菌不同株系中比較保守。

2.4.2 菌株SXAU- S1 堿性磷酸酶基因的表達 陽性表達重組菌不同裂解液的SDS- PAGE 電泳結果如圖6- B 所示，結果顯示，誘導后的菌體裂解液中，在38 ku 附近有一條明顯的蛋白條帶，其大小符合以該基因翻譯后多肽鏈計算的結果。

2.4.3 重組菌裂解液堿性磷酸酶活性測定 以NBRIP 液體為底物，加入誘導表達后的菌體裂解液，28 ℃反應30 min 后，檢測溶液中的有效磷含量，結果顯示，含量達到了941.97 mg/L。根據稀釋倍數計算，重組菌裂解液溶磷活性為原始菌株最優培養條件下的32.77 倍。

3 結論與討論

目前，對解磷菌的研究以芽孢桿菌、假單胞菌、伯克氏菌等為主[17-20]，且得到的解磷菌活性普遍較低，有效溶磷能力最高的為215.43 mg/L。本試驗從磷礦堆積區篩選得到的菌株為成團泛生菌，作為溶磷菌在以前還鮮有報道。在本試驗條件下，該菌的最大溶磷量達到了287.48 mg/L，遠遠高于前面文獻的試驗結果。在培養基條件方面，不同碳源會改變產生的有機酸影響解磷菌的生長濃度和解磷效果[5]，衛星等[21]篩選出的巨大芽孢桿菌以葡萄糖為碳源時解磷量高于以蔗糖、麥芽糖和淀粉為碳源，且研究發現，培養基中pH 的變化與菌株對碳源的利用次序一致，二者均表明菌株的產酸能力與碳源的利用順序一致。本研究得到的成團泛生菌株，以甘油為唯一碳源時解磷量高于以葡萄糖為唯一碳源，培養基中pH 的變化與菌株對碳源的利用次序也一致。在氮源方面，成團泛生菌優先利用無機氮，與常慧萍等[19]從小麥根際分離得到的假單胞菌對氮源的選擇顯著不同，表明菌株的生理特性與其來源相適應。該特點也使本試驗中的成團泛生菌很適于應用到采礦區等地的復墾上，對于解決礦區難溶性磷轉化問題、改善土壤環境、為礦區作物和中藥材的生長提供良好的保障具有重大意義。該菌株堿性磷酸酶蛋白的體外表達也為該酶的工業應用提供了試驗基礎。

本研究從磷礦區土壤篩選得到1 株具有高溶磷活性的解磷菌，經16S rDNA 鑒定其為成團泛生菌。對其培養條件進行了優化，確定了最佳碳源為甘油，最佳氮源為氯化銨。另外，還克隆了該菌中的堿性磷酸酶，并在大腸桿菌中實現了異源表達。