耐鉛菌與生物炭、有機肥配施對鉛污染土壤的修復效果

郜雅靜，李建華，靳東升，盧晉晶，籍晟煜，張云龍，郜春花

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院農業環境與資源研究所，山西太原030031）

鉛作為農業環境中主要的重金屬污染元素之一，主要隨著大量礦山的挖掘，工業廢氣、廢水、廢渣的亂排，農業肥料的噴施，日常垃圾的堆棄等途徑，沉積到農田土壤中，且很難被降解，最終隨著土壤—植物—動物逐級累積，最終進入人體，對人類的健康和生存構成威脅[1]。我國是一個典型的生產與消耗鉛的大國，每年鉛礦開采量高達90 萬t，其中，超過40萬t 被消耗[2]。2010 年李國平[3]調查發現，我國糧食含Pb 量大于1.0 mg/kg 的產地有11 個。鉛是土壤中很常見并且分布十分廣泛、含量也較高的重金屬元素[4]，它可以通過改變土壤微生物活性，影響土壤生態平衡，導致土壤功能失調、土質惡化等一系列環境問題。

目前，重金屬污染土壤修復已經開展了許多工作，就修復技術比較，生物修復具有費用低、效果好等優勢，具有良好的發展前景[5-6]。由于某些微生物對污染土壤中的重金屬具有氧化還原、吸附、沉淀的作用，它們可以通過降低重金屬的毒性，改善植物根際環境，增加土壤肥力，促進植株的生長。但是直接施加微生物可能會導致微生物流失或被吞噬，對重金屬的固定能力有限，而且微生物生長的代謝能力不佳。一些研究將微生物吸附于載體上，再加入污染土壤中，發現載體可以為微生物生長提供營養源和保護區域，有利于微生物較快適應新環境[7]。所以本研究運用生物強化技術，將耐鉛菌聯合生物炭、有機肥來修復鉛污染土壤，以提高修復效率。

山西省農業科學院農業環境與資源研究所農業微生物課題組前期從太原市重金屬污染土壤中篩選出耐鉛菌（GDYX03），通過16S rDNA 序列分析鑒定為腸桿菌屬（Enterobacter），利用透射電鏡和紅外光譜分析該菌可知，其主要依靠細胞表面吸附Pb2+。確定了該菌株在鉛污染水體中吸附的最佳條件是菌齡72 h，pH 值5～6，接菌量5 g/L，溫度30 ℃，時間30 min，初始Pb2+濃度100 mg/L，在此最佳條件下吸附率達98.85%，吸附量達19.73 mg/g[8]。生物炭具有孔隙大、表面活性大、吸附能力強等優勢，被廣泛應用于重金屬的修復。另外，它還具有性質極穩定的碳結構，能夠增加有機質含量、增強土壤肥力[9]、改良土壤性質、增加作物產量[10]。有機肥能夠為微生物提供所需的養分，提高微生物在土壤中的代謝能力。同時，有機肥的加入，還可以提高土壤肥力、促進土壤養分的轉換，疏松土壤、改善土壤微環境。

本試驗將耐鉛菌分別聯合生物炭、有機肥對鉛污染土壤的修復效果進行研究，以期為重金屬鉛污染修復提供一定的技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 其由山西省農業科學院農業環境與資源研究所農業微生物課題組從太原市污染土壤中分離篩選，經鑒定為腸桿菌屬（Enterobacter ludwigii）GDYX03。該菌株形態呈擴展形，表面光滑凸起，易挑起，乳白色且半透明，為革蘭氏陰性菌。

1.1.2 供試載體 市售的生物炭、商品有機肥，其基礎性質分別列于表1，2。

表1 生物炭理化性質

表2 有機肥的養分含量

1.1.3 供試作物 青美油菜（Brassica napus L.），購于山西瑞豐種業。

1.1.4 供試污染土壤制備 添加一定濃度的外源鉛溶液，加入去離子水，使土壤水分達到田間持水量的70%，充分混勻裝入塑料框中，干濕交替，老化10 個月，獲得一定鉛濃度的試驗土壤[11]，具體性質列于表3。

表3 土壤基礎性質

1.2 試驗設計

試驗設置12 個處理（表4）。所用土壤過2 mm篩，載體與土壤混勻后裝盆，每盆2 kg 土，同時加入基肥20 g（N∶P2O5∶K2O＝4∶3∶3）從育苗盤挑選長勢均勻的3 株移入，以稱重法保持土壤含水量在田間持水量的75%左右。4 個菌梯度分4 次加入，生長時間55 d。生物炭和有機肥用量參考王婷[7]試驗的用量。

1.3 樣品采集

1.3.1 植株樣品的采集 收獲時，用小鏟子將植株完整地從盆中輕輕挖出，分離地上、地下部，先用自來水沖洗干凈泥土，再用去離子水沖洗干凈，105 ℃殺青30 min，然后65 ℃烘干，粉碎，裝入自封袋中儲存，用于測定植株鉛含量。

表4 耐鉛菌與生物炭、有機肥配施的試驗處理 g/kg

1.3.2 土壤樣品的采集 挖起植株，采用抖落法收集根區土壤，用滅過菌的鑷子去除土壤中的雜質，其中，一部分裝入已編號的無菌自封袋，置于4 ℃冰箱，盡快進行微生物活性分析；一部分風干、磨碎、過篩，用于土壤中鉛含量的測定和土壤酶活性的分析。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 植株鉛含量 加入硝酸，高氯酸酸化，使用微波消解儀消解，采用火焰原子吸收分光光度計（240FSAA）測定植株鉛含量（mg/kg）[12]。

1.4.1.1 土壤有效態鉛含量 用DTPA（二乙三胺五乙酸）浸提劑（0.005 mol/L DTPA＋0.1 mol/L TEA（三乙醇胺）＋0.01 mol/LCaCl2） 浸提，0.45 μm 微孔濾膜過濾， 采用火焰原子吸收分光光度計（240FSAA）測定土壤有效鉛含量（mg/kg）[13]。

1.4.1.2 土壤總鉛含量 加入鹽酸- 硝酸- 氫氟酸- 高氯酸酸化，微波消解儀消解，采用火焰原子吸收分光光度計（240FSAA）測定土壤總鉛含量（mg/kg）[13]。

1.4.2 土壤酶活性 脲酶活性采用苯酚鈉- 次氯酸鈉比色法測定；磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉法測定；蔗糖酶活性采用3，5- 二硝基水楊酸比色法[14]測定。過氧化氫酶活性采用紫外分光光度法[15]測定。

1.4.3 土壤微生物數量 其采用稀釋平板計數法測定，其中，細菌培養使用牛肉膏蛋白胨培養基，放線菌培養使用改良高氏Ⅰ號培養基，真菌培養使用孟加拉紅培養基[16]。

1.5 數據統計

盆栽試驗數據用4 個重復的平均數±標準偏差表示；差異顯著性用SPSS 18.0 軟件進行Duncan法檢驗（P＜0.05 表示差異達顯著水平）。采用Microsoft Excel 2007 軟件作圖。

式中，C地上為油菜地上部鉛含量（mg/kg）；C地下為油菜地下部鉛含量（mg/kg）；C土壤為土壤殘留鉛含量（mg/kg）。

2 結果與分析

2.1 耐鉛菌與不同吸附載體配施對油菜生物量的影響

表5 耐鉛菌與不同吸附載體配施對油菜生物量的影響

從表5 可以看出，與CK 相比，其他處理油菜地上部、地下部生物量都增加，地上部鮮質量顯著增加，地下部鮮質量（除J 處理外）、地上部干質量和地下部干質量除J、T 處理外，其余處理均顯著增加。F、J 配施處理的4 種生物量都大于T、J 配施處理，主要是由于加入的有機肥為鉛污染土壤帶來豐富的有機質，改善了土壤性質，提高了土壤肥力，促進了植物生長[17]。隨著接菌量的增加，油菜地上部鮮質量、地下部鮮質量、地上部干質量、地下部干質量4 種生物量都表現為先增大后減小。在生物炭、有機肥2 種載體與不同接菌量配施處理后，生物量分別在T＋J2、F＋J2 處理達到最大值，T＋J2 處理4 種生物量較CK 分別增加27.16%，40.59%，15.81%，35.71%；F＋J2 處理4 種生物量較CK 分別增加34.06%，84.12%，18.70%，77.86%。

2.2 耐鉛菌與不同吸附載體配施對油菜鉛含量的影響

2.2.1 耐鉛菌與不同吸附載體配施對油菜地上部鉛含量的影響 從圖1 可以看出，與CK 相比，各處理油菜地上部鉛含量均出現顯著降低，降幅達到11.96%～56.78%。CK、J、T、F 處理油菜地上部鉛含量由大到小分別為CK＞J＞F＞T。與CK 相比，T、J配施處理和F、J 配施處理的油菜地上部鉛含量降幅分別為49.33%～56.78%，20.78%～30.40%，T、J配施處理降幅較大。在生物炭、有機肥分別與4 個菌梯度配施處理中，隨著接菌量的增加，油菜地上部鉛含量先減少后增加，其中，T＋J2、F＋J2 處理油菜地上部鉛含量最低，分別為17.72，30.01 mg/kg。

2.2.2 耐鉛菌與不同吸附載體配施對油菜地下部鉛含量的影響 由圖2 可知，耐鉛菌與吸附載體不同配施對油菜地下部鉛含量的影響與地上部鉛含量變化一致，與CK 相比，其他處理油菜地下部鉛含量也均顯著降低，且T、J 配施處理降低得較多。T、J 配施處理和F、J 配施處理油菜地下部鉛含量分別為309.90～329.32，334.95～370.08 mg/kg。其中，T＋J2、F＋J2 處理油菜地下部鉛含量最低，分別為309.90，334.95 mg/kg， 分別較CK 降低22.94%，16.71%。

與CK 相比，不同處理均能顯著降低油菜地上部、地下部鉛含量。這可能是因為植物對金屬的吸收量主要取決于土壤有效態重金屬濃度。耐鉛菌與生物炭、有機肥配施后可調節土壤微生態環境，促進養分活化，增加植物生物量；同時達到降低土壤有效態鉛含量的效果，減少了植物對鉛的吸附作用。董同喜等[18]研究發現，畜禽糞便可降低水稻土中重金屬的生物有效性，進而降低水稻的重金屬鉛含量；曹書苗等[19]通過研究也發現，加入生物肥可降低黑麥草土壤有效態鉛含量，導致黑麥草地上和根部鉛含量降低。這與本研究結果相似。

2.3 耐鉛菌與不同吸附載體配施對油菜中鉛轉移因子、富集系數的影響

由表6 可知，與CK 相比，其他處理油菜中鉛轉移因子和富集系數都降低。T、J 配施處理轉移因子、地上部富集系數、地下部富集系數、總富集系數較CK 分別降低37.23%～49.32%，24.15%～30.96%，50.27%～58.60%，25.84%～33.64%。F、J 配施處理轉移因子、地上部富集系數、地下部富集系數、總富集系數較CK 分別降低13.31%～21.75%，9.50%～20.54%，25.36%～36.68%，11.13%～22.03%。其中，T＋J2、F＋J2 處理地上部富集系數、地下部富集系數、總富集系數均最小，T＋J2 處理的3 種富集系數分別較CK 降低30.96%，58.60%，33.64%，F＋J2 處理的3 種富集系數分別較CK 降低20.54%，36.68%，33.64%。

鉛主要積累于植株根系中，地下部分對鉛的富集能力遠高于地上部分，導致地下部分鉛含量高于地上部分。說明鉛不易在植株體內轉運，由轉運因子也可以看出，加入吸附載體后增加了油菜生物量，降低了油菜地上部、地下部鉛含量，這有利于控制植株體內的鉛殘留[20]。石汝杰等[21]研究發現，鉛更易于被黑麥草地下部吸收，不同處理地下部累積鉛含量均大于地上部，這與本試驗研究結果一致。植株受鉛脅迫生長后，隨著土壤中鉛含量增加，油菜地上部和地下部的鉛含量也增加，土壤中鉛含量與植株內部鉛含量有一定的相關性。曹書苗[17]在研究黑麥草對鉛的耐受性和積累時也得出相似的結果。

表6 耐鉛菌與不同吸附載體配施對油菜中鉛轉移因子、富集系數的影響

2.4 耐鉛菌與不同吸附載體配施對土壤鉛含量的影響

2.4.1 耐鉛菌與不同吸附載體配施對土壤有效態鉛含量的影響 重金屬有效態可反映重金屬移動性、毒性和生物有效性，其受土壤重金屬總量、有機質含量等多種因素影響[22]。從圖3 可以看出，與CK相比，其他處理土壤有效態鉛含量均出現顯著降低，降幅達9.67%～21.76%。在生物炭、有機肥分別與4 個菌梯度配施處理中，T＋J2、F＋J2 處理土壤有效態鉛含量最低，較CK 分別降低21.76%，12.61%。加入生物炭對降低土壤有效態鉛含量效果較大，可能是因為生物炭有很大的比表面積，且帶負電荷，能與重金屬陽離子發生靜電吸附作用，吸附土壤中大量的重金屬離子，從而減少重金屬在土壤中的轉化[23]。CAO 等[24]研究發現，在200 ℃下制備的牛糞生物炭對土壤中Pb2+的吸附量最大達到680 mmol/kg。LU 等[25]研究表明，生物炭吸附土壤鉛離子的主要途徑是鉛離子與生物炭的含氧官能團發生表面吸附以及在礦物質表面生成絡合物。

2.4.2 耐鉛菌與不同吸附載體配施對土壤殘留鉛含量的影響 從圖4 可以看出，與CK 相比，其他處理土壤殘留鉛含量均增加，增幅達到2.47%～11.78%。在生物炭、有機肥分別與4 個菌梯度配施處理中，T＋J2、F＋J2 處理殘留鉛含量最大，分別為949.70，891.33 mg/kg， 分別較CK 增加11.78%，4.91%。通過添加生物炭、有機肥使土壤重金屬的固定增加，導致土壤有效態鉛含量降低，增加了土壤殘留鉛含量。因為生物炭對土壤鉛含量的固定量多于有機肥，因此，生物炭與接菌量配施處理土壤殘留鉛含量較多。

2.5 耐鉛菌與不同吸附載體配施對土壤酶活性的影響

土壤酶活性一定程度上能夠反映土壤的養分含量和受污染程度。從表7 可以看出，耐鉛菌與2 種吸附載體配施后均能增加鉛脅迫下土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶活性。2 種載體與不同接菌量配施處理后4 種酶活性均表現為先增大后減小，當接菌量為J2（0.5 g/kg）時，酶活性最大。T＋J2處理過氧化氫酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶活性分別為1.674，4.258，0.053，0.451 mg/g；F＋J2 處理4 種酶活性分別為1.717，4.832，0.057，0.495 mg/g。

表7 耐鉛菌與不同吸附載體配施對土壤酶活性的影響

從表7 還可看出，生物炭與不同接菌量配施處理后過氧化氫酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶活性較CK分別增加0.92%～3.77%，2.70%～5.39%，6.14%～21.47%，4.68%～34.71%；有機肥與不同接菌量配施處理后4 種酶較CK 分別增加3.97% ～6.44%，11.28%～19.61%，14.39%～29.72%，30.00%～47.66%，4 種酶活性全部表現為F、J 配施處理較T、J 配施處理增加較大。可能是因為有機肥能改善土壤的呼吸作用，增強土壤微生物活性，促進土壤養分和能量轉化，對鉛污染土壤微環境有明顯的改善作用[26]。楊繼飛[27]研究發現，在鉛污染土壤上施用菌肥、腐植酸，能降低重金屬鉛的毒害，提高植株含量，增加根際土壤中活性，施用菌肥和腐植酸可以達到修復鉛污染土壤的目的。楊海征[28]研究發現，雞糞堆肥一定程度上提高了重金屬污染下茼蒿根際土壤中脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性。郭文娟等[29]研究發現，在土壤中加入生物炭，均有增加土壤過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶活性的作用，3 類酶分別增加10.2%～34.9%，18.0%～38.5%，0.7%～13.4%。

2.6 耐鉛菌與不同吸附載體配施對土壤微生物區系的影響

土壤微生物作為土壤生物特性的重要組成部分，是評價土壤環境質量的指標之一，比較耐鉛菌與不同吸附載體配施對微生物區系的影響（表8），結果表明，與CK 相比，不同處理土壤真菌、放線菌、細菌數量均顯著增加。隨接菌量的增加，耐鉛菌與生物炭、有機肥配施后真菌、放線菌數量均表現為先增加后減少，在2 種載體分別與J2 配施時達到最大值。其中，T＋J2 處理真菌、放線菌分別較CK增加59.39%，49.47%，F＋J2 處理真菌、放線菌分別較CK 增加72.68%，59.10%。隨著接菌量的增加，土壤細菌數量表現為遞增趨勢，2 種載體分別與J4 配施后達到最大值，T＋J4、F＋J4 處理較CK 分別增加1 322.43%，1 470.93%。隨著接菌量的增加，土壤中細菌增加速度最快，主要是因為耐鉛菌本身是細菌，能在土壤中大量繁殖。馮莉等[30]研究發現，利用熒光假單胞菌能夠增加煙草根際土壤細菌和放線菌的數量，降低真菌的數量，這與本研究結果相似。3 類微生物數量均是F、J 配施處理較T、J 配施處理增加較多。這可能是因為有機肥含有豐富的碳水化合物和N、P、K 等礦質營養，可提高土壤通氣性，不僅為微生物生長提供碳源和氮源，還能創造良好的生存環境，刺激土壤中微生物生長繁殖[31]。張連忠等[32]研究發現，有機肥施用可提高果園根區土壤細菌、放線菌、真菌的數量，有機肥還可明顯減輕Cd、Cu 對土壤微生物的危害，減輕重金屬對土壤的污染。

3 結論

當生物炭和有機肥作為載體分別以20 g/kg 添加量與0.5 g/kg 耐鉛菌配施時對鉛污染土壤修復效果最佳，有效減緩了鉛對蔬菜的脅迫作用，顯著促進油菜的生長，同時減少油菜體內鉛富集，降低土壤有效態鉛含量、增加土壤酶活性和微生物多樣性。生物炭與有機肥作為外來營養源不僅能夠作為耐鉛菌的載體，提供微生物生長所需要的養分，顯著改善土壤生態環境，還可以吸附重金屬，提高生物強化技術對污染土壤的修復效果。