腸易激綜合征患者腸道菌群特征和NOX1表達的研究*

盛淑婷 魏子白 王云峰 楊長青

長治醫學院附屬和平醫院消化科(046000)

背景：研究表明腸道菌群、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)在慢性內臟痛形成中起有重要作用，但其在腸易激綜合征(IBS)中的作用尚不明確。目的：探討IBS患者腸道黏膜菌群特征與NOX1表達的相關性。方法：收集2017年7月—2017年12月長治醫學院附屬和平醫院收治的符合羅馬Ⅳ標準的IBS患者和健康受試者結腸黏膜標本，利用高通量測序方法檢測腸道黏膜菌群，并分析菌群物種多樣性和豐度。采用免疫組化法測定結腸黏膜NOX1表達。結果：IBS組和對照組腸道黏膜菌群以擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門為主。IBS-D組、IBS-U組和對照組之間菌群多樣性相比差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，IBS組Tissierella豐度明顯增加(H=6.688，P<0.05)，Granulicatella豐度明顯降低(H=6.212，P<0.05)。與對照組和IBS-U組相比，IBS-D組Porphyromonas、Marmoricola、Cardiobacterium豐度明顯增加(P均<0.05)。與對照組相比，IBS-U組、IBS-D組NOX1表達增加(P<0.01)。腸黏膜NOX1表達與Tissierella豐度存在正相關性(r=0.611，P<0.05)，但與Granulicatella豐度無明顯相關性(r=0.253，P=0.376)。Tissierella、Granulicatella豐度、NOX1表達與IBS嚴重程度無明顯相關性(P>0.05)。結論：IBS患者與健康受試者的腸道黏膜菌群多樣性無明顯變化，部分菌群豐度發生改變，且不同亞型的菌群豐度變化不同。IBS患者結腸黏膜NOX1表達上調，且與Tissierella豐度存在一定的相關性。

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)是常見的胃腸道疾病之一，主要癥狀為腹痛，可伴有排便習慣和糞便性狀的改變[1]。其發病率高，約占胃腸病門診患者的40%。目前IBS的具體發病機制仍不清楚，且無有效的治療方法。

活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)是由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase, NOX)家族產生的代謝中間產物，主要包括一些小分子物質，如超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)、次氯酸(CHClO)等。NOX1是NOX家族成員之一，主要表達于腸上皮細胞，參與宿主防御、蛋白質的翻譯、細胞信號轉導、基因表達調控、細胞分化等過程。NOX1作為一種生物氧化酶，可催化ROS分子如O2-和H2O2的形成[2-3]。研究表明，ROS與疼痛形成關系緊密。ROS可通過激活GTP酶Rab7介導炎性疼痛過程；通過激活鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ介導神經病性疼痛；ROS在癌性骨痛中亦起重要作用，且自由基清除劑對其治療有效[4-6]。但ROS是否可介導IBS患者內臟痛的形成，目前尚不明確。

腸道菌群紊亂是IBS發生、發展的重要機制之一。動物實驗發現，小鼠腸上皮細胞可通過NOX1介導ROS的產生，并維持腸道菌群穩態，但在IBS患者中的作用尚不明確。本實驗通過分析IBS不同亞型患者腸黏膜相關菌群特征、評估IBS癥狀嚴重程度量表并檢測腸黏膜NOX1表達，旨在探討腸道菌群、NOX1表達與IBS之間的相關性，從而為IBS的治療提供一種新思路。

材料與方法

一、資料來源

收集2017年7月—2017年12月長治醫學院附屬和平醫院收治的IBS患者，IBS診斷標準[7]：最近3個月內每月≥3 d具有反復發作的腹痛或腹部不適，且伴有≥2個下列癥狀：①排便后癥狀改善；②排便頻率改變；③糞便性狀改變。在診斷前6個月出現癥狀，近3個月癥狀發作符合上述診斷標準，且經結腸鏡檢查無異常者。根據羅馬Ⅳ標準將IBS分為四種亞型：便秘型IBS(IBS-C)、腹瀉型IBS(IBS-D)、混合型IBS(IBS-M)、不定型IBS(IBS-U)。納入標準：①年齡18～65歲；②血尿便常規檢查無明顯異常；③腹部超聲、結腸鏡檢查無異常。排除標準：①合并有其他疾病；②有腹部手術史；③近1個月內曾連續使用抗菌藥物超過3 d；④近2周內連續服用益生菌、通便藥、止瀉藥、促動力藥超過3 d；⑤年齡<18歲或>65歲；⑥處于經期、妊娠期或哺乳期婦女。同時以同期性別、年齡、生活環境等基本情況與IBS患者均匹配的健康體檢者作為對照。本研究方案由長治醫學院附屬和平醫院倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1. IBS患者癥狀嚴重程度評估：由IBS患者根據自身情況填寫IBS癥狀嚴重程度量表(IBS-SSS)，完成后由分發量表者進行檢查并補充完整，然后計算評分。

2. 標本收集和保存：所有入選者于檢查前晚晚餐后禁食，檢查前5 h，將聚乙二醇電解質散(購自江西恒康藥業有限公司)139.12 g溶于2 L溫開水中，每10 min服用250 mL，于2 h內服完。在距肛門近端25～35 cm處取黏膜組織2塊，1塊立即保存于-80 ℃液氮中，用于腸道黏膜菌群多樣性和豐度的檢測；另一塊置于90%乙醇中固定，石蠟包埋、保存，用于腸道黏膜NOX1表達的檢測。

3. 菌群測序：利用細菌基因組DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，提取腸道黏膜菌群DNA，具體步驟嚴格按照說明書進行操作。由上海銳翌生物科技有限公司行16S rDNA擴增子測序。

4. 免疫組化法測定腸黏膜NOX1表達：采用兩步法進行免疫組化染色。脫蠟、水化，PBS清洗5 min×3次；3% H2O2封閉10 min；高壓抗原修復，PBS清洗5 min×3次；胎牛血清封閉10 min；加入一抗(Abcam公司，工作濃度1∶250)4 ℃過夜；37 ℃復溫30 min，PBS清洗5 min×3次；加入二抗，37 ℃孵育20 min，PBS清洗5 min×3次；DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察并攝片。結果判定：細胞質內出現黃褐色顆粒沉淀為細胞陽性。每張切片選取視野清晰的5個不重復的高倍鏡視野(×400)，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計算積分光密度值并取均值。

三、統計學分析

結 果

一、一般情況

共25例IBS患者納入研究，其中男11例，女14例，平均年齡(47.16±11.01)歲。IBS-U患者10例，其中男2例，女8例，平均年齡(48.40±12.01)歲。IBS-D患者15例，其中男9例，女6例，平均年齡(46.33±10.64)歲。健康對照組13名，其中男6名，女7名，平均年齡(48.62±11.94)歲。IBS患者與健康對照組性別(χ2=0.016，P>0.05)、年齡(t=0.376，P>0.05)相比差異無統計學意義，IBS-D組與IBS-U組性別(χ2=2.442，P>0.05)、年齡(t=-4.52，P>0.05)相比差異亦無統計學意義。

二、腸黏膜菌群組成分析

IBS-D組、IBS-U組和對照組腸道黏膜相關菌群在所有菌屬水平組成見圖1，其中門水平上組成以變形菌門(分別為37.8%、43.2%、46.6%)、厚壁菌門(分別為29.5%、26.4%、29.1%)、擬桿菌門(分別為25.4%、23.7%、16.7%)為主(圖2)。

三、腸黏膜菌群多樣性分析

Alpha多樣性分析顯示，IBS-D組、IBS-U組和對照組Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數相比差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

四、腸黏膜菌群豐度差異分析

與對照組相比，IBS組Granulicatella豐度明顯降低(H=6.212，P<0.05)，Tissierella豐度明顯升高(H=6.688，P<0.05)。IBS-D組Porphyromonas、Marmoricola、Cardiobacterium豐度較IBS-U組和對照組明顯增加(P均<0.05)(表2)。

圖1 三組患者所有水平差異物種的Heatmap圖

圖2 腸黏膜菌群在門水平上的相對豐度圖

五、腸黏膜NOX1表達分析

免疫組化結果顯示，IBS和對照組中均可見NOX1表達陽性著色細胞，IBS組NOX1表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(0.140 8±0.002 0對0.126 9±0.004 5，P<0.05)，而IBS-D組和IBS-U組相比差異無統計學意義(0.141 2±0.002 3對0.139 3±0.003 5，P>0.05)(圖3)。

表1 各組腸黏膜菌群Alpha多樣性分析

表2 各組腸黏膜菌群豐度差異分析

**P<0.05

A：IBS組(免疫組化法，×400)；B：對照組(免疫組化法，×400)；C：IBS組、對照組NOX1表達比較；D：IBS-D組、IBS-U組NOX1表達比較

圖3 各組腸黏膜NOX1表達

六、相關性分析

1. 腸黏膜NOX1表達與菌群的相關性：Pearson相關分析發現，NOX1表達與Tissierella豐度存在正相關性(r=0.611，P<0.05)，但與Granulicatella豐度無明顯相關性(r=0.253，P=0.376)。

2. 菌群、NOX1表達與IBS-SSS的相關性：Pearson相關分析發現，Granulicatella、Tissierella豐度、NOX1表達與IBS-SSS評分均無相關性(r=-0.153，P=0.459；r=-0.149，P=0.512；r=0.611，P=0.763)。

討 論

有證據表明，涉及內臟痛覺的中樞或外周機制可能受到腸道菌群的影響，如乳酸桿菌和雙歧桿菌屬可減輕應激和IBS引起的內臟疼痛[8]；大鼠攝入嬰兒雙歧桿菌35624會增加疼痛閾值并減少結直張擴張(CRD)后的疼痛行為[9]。本實驗發現，IBS患者腸道菌群以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為主，IBS組和對照組菌群多樣性相比無明顯差異，IBS亞型間相比亦無明顯差異。與對照組相比，IBS組Granulicatella豐度明顯降低，Tissierella豐度明顯升高。此外，IBS-D組Porphyromonas、Marmoricola、Cardiobacterium豐度較對照組和IBS-U組明顯增加(P均<0.05)。但Ait-Belgnaoui等[8]的研究發現，與健康對照組相比，IBS患者腸道差異菌群主要為嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、檸檬酸桿菌等。各項研究結果的不一致可能與研究對象種族、飲食、生活習慣和地理環境以及取樣差異、檢測方法等因素有關。

腹痛是IBS患者的常見癥狀之一。研究表明，腸道菌群可通過其代謝產物5-羥吲哚乙酸來增加血漿色氨酸濃度，影響中樞神經系統中5-羥色胺(HT)的傳遞[10]，使下丘腦對內臟疼痛的反應增強，加重IBS癥狀。目前關于腸道細菌Tissierella的研究較少。研究發現，在急性心肌梗塞小鼠模型中Tissierella數量明顯升高，但具體機制尚不清楚[11]，可能與IBS組Tissierella豐度升高原因一致。此外，本實驗發現IBS-D組Syntrophaceae豐度明顯高于對照組和IBS-U組，而有研究表明Syntrophaceae可分解代謝產生甲烷[12]，這可能與IBS-D患者腹脹、腹部不適有關。

目前，關于NOX1的研究多集中于氧化還原、細胞分裂和分化、傷口愈合等，其在穩定腸道微生態中的作用尚不清楚[13]。研究[14]發現，在敲除NOX1基因的小鼠中，鼠沙門桿菌對盲腸細菌濃度和整體組成無明顯影響。但另一項感染檸檬酸桿菌的小鼠模型發現，敲除NOX1基因的小鼠盲腸內球菌數量較較正常小鼠減少，疾病狀態改善[15]。說明腸道微生態與NOX1表達有關。

由NOX催化產生的ROS如H2O2為多種細胞內信號通路的關鍵調節因子。ROS調節細胞信號轉導的機制是通過氧化特定的活性半胱氨酸殘基而實現的，這些基團位于控制細胞信號通路激活的酶中。因此，含有活性半胱氨酸殘基的蛋白質具有氧化還原感受器的功能，并轉導由ROS介導的信號。ROS氧化活性半胱氨酸殘基這一性質，對于內臟疼痛的發生具有重要意義。

ROS是痛覺過敏的介質[16]。研究[4]發現ROS通過氧化Rab7來介導炎癥性疼痛過程；Kogure等[17]的研究發現，H2O2可通過激活瞬時受體電位陽離子通道A1(transient receptor potential ankyrin 1 cation channel, TRPA1)來介導內臟疼痛；乳酸桿菌可刺激小鼠遠端小腸和結腸中FPR1受體，并通過NOX1迅速產生生理濃度的ROS，并刺激結腸中ROS依賴性細胞增殖[18]。Matziouridou等[19]的研究發現，腸道細菌數量、組成和移位可能受ROS產生的調節；Pircalabioru等[15]的研究表明NOX1對腔細菌具有調節作用。故推測腸道菌群可通過腸上皮細胞中NOX1表達來介導ROS的產生，從而影響IBS的形成與發展，但目前關于此方面的研究較少。本研究發現，與對照組相比，IBS組腸黏膜上皮細胞中NOX1表達明顯增高(P<0.05)，而IBS-U與IBS-D患者之間無明顯差異(P>0.05)。但由于條件限制，本實驗未能進一步研究IBS腸道差異菌群與NOX1表達間的作用機制。

總之，本研究發現，IBS患者和健康志愿者間腸道菌群在種類數目上并無明顯差異，但特定菌群的相對豐度發生改變，且不同亞型的菌群豐度變化不同。結腸黏膜NOX1表達與Tissierella豐度存在正相關性，與Granulicatella豐度無明顯相關性，但現有研究并未發現差異菌群Granulicatella、Tissierella與NOX1表達間的聯系，這或許是研究IBS發生、發展機制的一個新方向。