利用KASP標記檢測青海和西藏小麥品種中光周期基因分布

權有娟，袁飛敏，劉德梅，李 想，陳志國

(1.中國科學院西北高原生物研究所/中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室/青海省作物分子育種重點實驗室，青海西寧 810008; 2.中國科學院大學，北京 100049; 3.西北農(nóng)林科技大學，陜西楊凌 712100)

小麥是世界上第三大糧食作物，也是我國的主要糧食作物。普通小麥對不同環(huán)境的適應性受開花時間影響較大[1]，主要由3種基因決定，分別是春化基因(Vrn)、光周期基因(Ppd)和早熟性基因(Eps)[2]，前兩者易受環(huán)境的影響，后者不受環(huán)境影響。其中，光周期反應主要由3個同源主效基因控制，即Ppd-D1(Ppd1)、Ppd-B1(Ppd2)和Ppd-A1(Ppd3)，分別位于小麥2D、2B和2A染色體上[3-4]。只有在長日照條件下才能開花的小麥為光周期敏感類型，在長日照或短日照條件下均可開花的小麥為光周期不敏感類型[5]。通常認為等位變異Ppd-D1a對光周期反應最不敏感，其次是Ppd-B1a、Ppd-A1a[8]，但Tanio等[9]證實Ppd-B1a和Ppd-D1a的光周期效應相同。目前鑒定的小麥光周期基因均有光周期不敏感型等位變異Ppd-D1a、Ppd-B1a、Ppd-A1a和光周期敏感型等位變異Ppd-D1b、Ppd-B1b、Ppd-A1b兩種等位變異類型[6-7]。光周期基因不僅影響著小麥的生育期和產(chǎn)量,而且對小麥的適應性、種質(zhì)資源創(chuàng)制、新品種引種和擴大種植范圍等極其重要[10]。

功能標記在作物育種過程中發(fā)揮著重要作用，在小麥中已獲得100多個基因的功能標記，為育種家提供了一個對有利性狀選擇的分子工具箱[11]。Beales等[12]利用基因序列特異性開發(fā)了小麥光周期基因的功能標記，檢測出Ppd-D1b和Ppd-D1a兩種等位變異，Nishida等[13]利用同樣的原理檢測出了Ppd-B1和Ppd-A1的等位變異。KASP(kompetitive allele specific PCR)標記是近幾年在作物分子標記輔助與選擇育種中常用的方法，該標記技術具有高通量輔助篩選功能，使快速提高小麥育種效率和改良品種成為可能。Rasheed等[14]開發(fā)和鑒定了一些與普通小麥產(chǎn)量、品質(zhì)、適應性、抗性有關的KASP標記，證明KSAP標記的檢測速度是基于凝膠PCR分子標記的45倍。Semagn[15]等研究發(fā)現(xiàn)，KASP標記和傳統(tǒng)的SNP標記檢測技術相比，具有更高效、費用低、更精確的特點。

青藏高原是我國小麥高產(chǎn)區(qū)，但品種多在本地區(qū)表現(xiàn)適宜性好、高產(chǎn)，離開青藏高原往往表現(xiàn)不佳，難以適應。對其光周期反應加以研究，可以有助于了解高原品種的生態(tài)適應性。國內(nèi)外對光周期基因Ppd-D1的組成和分布研究較多，對Ppd-B1和Ppd-A1基因的研究較少。青藏高原地形復雜多樣，小麥類型豐富，對青海和西藏地區(qū)小麥品種光周期基因的組成和分布開展研究，可為今后在這一地區(qū)培育廣適小麥品種以及新品種引種、推廣提供理論理論支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試小麥品種(系)共計249份，包括70份青海省歷年審定品種、75份外引資源品種(系)、27份自育高代品系、42份青海農(nóng)家品種及35份西藏農(nóng)家品種，詳細信息見表1。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

供試品種(系)各挑選種子30粒，室溫條件下發(fā)芽，采用CTAB法[16]提取植物基因組總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度。

1.2.2 KASP標記檢測

實驗所需的KSAP標記引物由上海生工股份有限公司合成(表2)，引物序列參考Rasheed等[14]。FAM 5′端的標簽序列為：5′-GAAGGTG ACCAAGTTCATGCT-3′，VIC 5′端的標簽序列為：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′。共需3組混合引物，每組混合引物由2條各12 μL(100 μmol·L-1)的正向序列、1條的30 μL(100 μmol·L-1)反向共同序列及46 μL ddH2O組成。

表1 249份供試材料的名稱Table 1 Sources andnames of the 249 test materials

(續(xù)表1 Continued table 1)

序號 Number品種(系)名稱 Variety(line) name序號 Number品種(系)名稱 Variety(line) name序號 Number品種(系)名稱 Variety(line) name45青農(nóng)469 Qingnong 469128濟麥262 Jimai 262211蘭麥-2 Lanmai-246寧春26號 Ningchun 26129德抗961 Dekang 961212火麥 Huomai47互麥12號 Humai 12130晉2148 Jin 2148213和尚麥 Heshangmai48香農(nóng)3號 Xiangnong 3131太空8號 Taikong 8214青海北 Qinghaibei49高原392 Gaoyuan 392132京冬8號 Jingdong 8215怒江小麥 Nujiangxiaomai50青春587 Qingchun 587133京冬16 Jingdong 16216曲水小麥 Qushuixiaomai51高原466 Gaoyuan 46613403中35 03 zhong 35217紅穎無芒 Hongyingwumang52互麥14號 Humai 1413507中38 07 zhong 38218卓果索 Zhuoguosuo53樂麥6號 Lemai 6136陜農(nóng)69 Shaannong 69219短密穗長芒 Duanmisuichangmang54樂麥5號 Lemai 5137云麥53 Yunmai 53220半芒春麥 Banmangchunmai55通麥1號 Tongmai 1138遼春10號 Liaochun 10221貢嘎小麥 Gonggaxiaoami56青春6號 Qingchun 6139冀麥586 Jimai 586222早熟小麥 Zaoshuxiaomai57青春10號 Qingchun 10140綿陽096-61 Mianyang 096-61223宋噶小麥 Songgaxiaomai58墨引2號 Moyin 21418616M7224扎仁卓瑪 Zharenzhuoma59青加2號 Qingjia 2142新旱212 Xinhan 212225扎西布索 zhaxibusuo60高原671 Gaoyuan 671143新旱688 Xinhan 688226白小麥 Baixiaomai61互麥15號 Humai 1514411MJ557227扎其毛穎 Zhaqimaoying62青加1號 Qingjia 1145關東107 Guandong 107228柳鄉(xiāng)呸卓 Liuxiangpeizhuo63青春592 Qingchun 5921469097229古曲扎通 Guquzhatong64紫糯1號 Zinuo 114717478230恰噶小麥 Qiagaxiaomai65曹選3號 Caoxuan 314814609-24231丁青基卓 Dingqingjizhuo66新哲9號 Xinzhe 914914609-1232山南大碎粒 Shannandasuili67煙幅188 Yanfu 18815014609-2233仁達代光麥 Rendadaiguangmai68蘭考906 Lankao 90615114609-3234紋龍小麥 Wenlongxiaomai69馬品 Mapin1529099235扎西才卓瑪 Zhaxicaizhuoma70青春593 Qingchun 59315308654236昌都小麥 Changduxiaomai71甘麥8號 Ganmai 81549096237卓魯娜 Zhuoluna72定西24 Dingxi 241552109238早紅芒麥 Zaohongmangmai73甘麥35 Ganmai 351569101239左貢圓錐麥 Zuogongyuanzhuimai74隴春17 longchun 1715791771240白龍春麥 Bailongchunmai75隴春13 Longchun 13158121-4241變芒麥 Bianmangmai76甘春20 Ganchun 20159074242彼巴密穗 Bibamisui77隴春2609 Longchun 2609160056243隆子圓錐 Longziyuanzhui78張811 Zhang 811161052244尼木密穗 Nimumisui79武春4號 Wuchun 416290-1073245白當卓爾 Baidangzhuoer80蘭天3號 Lantian 316314313246臥龍波蘭 Wolongbolan81張春6號 Zhangchun 61649106247斗玉波蘭 Douyubolan82武春2號 Wuchun 21659161248洋松 Yangsong83甘春358786 Ganchun 3587861668337249加察碎穗麥 Jiachasuisuimai

1～70號為青海育成品種:71～145號為青海引進品種(系)；146～172號為青海高代品系；173～214號為青海農(nóng)家品種；215～249號為西藏農(nóng)家品種。

1-70 are bred varieties of Qinghai; 71-145 are introduced varieties(line) of Qinghai; 146-172 are high-generation lines of Qinghai; 173-214 are Qinghai landraces of Qinghai; 215-249 are landraces of Tibet.

檢測光周期基因等位基因型的PCR反應體系為5 μL，總體積中含2.0 μL DNA(10 ng·μL-1)，2.5 μL KSAP Master Mix(LGC Genomics，Hoddeston，UK)、0.07 μL KSAP及 0.43 μL ddH2O。設置用ddH2O 代替模板DNA的空白對照，以防對試驗結果造成誤判。PCR在S1000TMThermal Cycler PCR儀上進行。PCR反應程序為：95 ℃，15 min；95 ℃變性 20 s，65 ℃退火和延伸25 s，57 ℃退火和延伸60 s，30個循環(huán)。反應結束后進行熒光掃描和基因分型分析。

表2 光周期基因的KASP標記引物Table 2 KASP primers used in this study for photoperiod genes

該表中橫杠不代表引物序列缺失，而表示TaPpdBJ003中沒有FAM引物序列。

The dotted line in this table indicates there is no FAM primer sequence in TaPpdBJ003.

2 結果與分析

2.1 光周期基因位點等位變異的KASP檢測 結果

2.1.1Ppd-D1位點鑒定結果

利用TaPpdDD001、TaPpdDI001和 TaPpdDD002引物組合對供試材料進行Ppd-D1基因位點的等位變異檢測。結果(表3及其注釋)顯示，青海的42份農(nóng)家品種中，紅農(nóng)1號、大莊火麥、群科大白麥等41份材料中檢測出光周期不敏感型等位變異Ppd-D1a，僅有蘭麥-2含有光周期敏感型等位變異Ppd-D1b；75份外引資源中，甘春20、巴豐5號、寧春4號等64份材料檢測到含有光周期不敏感型等位變異Ppd-D1a，晉2148、關東107、內(nèi)麥18等11份材料檢測出了光周期敏感型等位變異Ppd-D1b；70份育成品種中，柴春044、柴春901、高原448等60份材料檢測出光周期不敏感型等位變異Ppd-D1a，煙幅188、高原602、樂麥6號等10份材料檢測出光周期敏感等位變異Ppd-D1b；27份高代品系中，24份材料檢測出光周期不敏感型等位變異Ppd-D1a，056、08654、97-2051檢測出光周期敏感型等位變異Ppd-D1b。在35份西藏農(nóng)家品種中，尼木密穗、昌都小麥、曲水小麥等32份材料檢測出光周期不敏感型等位變異Ppd-D1a，彼巴密穗、怒江小麥、紋龍小麥檢測出光周期敏感型等位變異Ppd-D1b。

2.1.2Ppd-B1位點的鑒定結果

用TaPpdBJ001、TaPpdBJ003引物組合對供試材料進行Ppd-B1基因位點的等位變異檢測，結果(表3及其注釋)表明，青海42份農(nóng)家品種、75份引進品種、27份高代品系都只攜帶光周期不敏感型等位變異Ppd-B1a；70份育成品種中，只有高原314攜帶光周期敏感型等位變異Ppd-B1b，其余材料均為光周期不敏感型Ppd-B1a。西藏的35份農(nóng)家品種中，卓果索、宋噶小麥、卓魯娜等24份材料攜帶光周期不敏感型等位變異Ppd-B1a，仁達代光麥、山南大碎粒、恰噶小麥等11份材料攜帶光周期敏感型等位變異Ppd-B1b。

2.1.3Ppd-A1位點的鑒定結果

引物組合Cdex5-6ID、GS100-1027ID和GS105-1117ID在Ppd-A1基因位點的等位變異檢測結果(表3及其注釋)表明，青海的42份農(nóng)家品種中，僅有大紅頭麥攜帶光周期敏感型等位變異Ppd-A1b，其余品種均攜帶光周期不敏感型等位變異Ppd-A1a；75份引進品種中，濟麥17號、蘭考906、良星99等67份材料攜帶光周期不敏感型等位變異Ppd-A1a，張春6號、甘麥35、武科2246等8份材料攜帶光周期敏感型等位變異Ppd-A1b；70份育成品種中，青春570、青春587、墨引2號等63份攜帶光周期不敏感型等位變異Ppd-A1a；高原V028、輻射阿勃、樂麥5號等7份材料攜帶光周期敏感型等位變異Ppd-A1b；27份高代品系均攜帶光周期不敏感型等位變異Ppd-A1a。西藏的35份農(nóng)家品種均攜帶光周期不敏感型等位變異Ppd-A1a。

2.2 光周期基因等位變異的分布

等位變異在249份材料中的平均分布頻率不同，3個光周期不敏感型等位變異中，Ppd-B1a和Ppd-A1a出現(xiàn)的平均比例均在90%以上，Ppd-D1a所占比例稍低一點，為88.76%。3個光周期敏感型等位變異中，Ppd-D1b出現(xiàn)的平均比例最高(占11.24%)，Ppd-A1b和Ppd-B1b的平均分布頻率均在10%以下(表3)。

青海不同類型小麥品種中，以光周期不敏感型等位變異Ppd-B1a為主，出現(xiàn)的頻率均在98%以上，其中，高代品系中還以光周期不敏感型等位變異Ppd-A1a為主(占100%)，光周期敏感型等位變異出現(xiàn)的頻率較少，最高為引進品種(系)中的Ppd-D1b(占14.67%)。青海和西藏小麥農(nóng)家品種中光周期基因等位變異的分布也存在差異，青海農(nóng)家品種以光周期不敏感型等位變異Ppd-B1a為主(占100%)，西藏農(nóng)家品種以光周期不敏感型等位變異Ppd-A1a為主(占100%)；光周期敏感型等位變異Ppd-B1b在西藏農(nóng)家品種中出現(xiàn)的頻率最高(占31.42%)，青海農(nóng)家品種中均在10%以下。

表3 光周期等位變異在青海和西藏小麥品種中的分布頻率Table 3 Distribution of alleles at photoperiod gene loci among Qinghai and Tibet wheat cultivars %

1～5、7～8、10～11、13～23、25～26、29～47、49～50、52、54～66、68～72、76～84、86～115、117～118、120～125、127～129、131～136、138～139、141～144、146～152、154～159、161～171、173～210、212～214、216～233、235～241、243～249號品種攜帶等位變異Ppd-D1a；6、9、12、24、27～28、48、51、53、67、73～75、85、116、119、126、130、137、140、145、153、160、172、211、215、234、242號品種攜帶等位變異Ppd-D1b；1～8、10～216、218～219、221、223～227、229、231、236～241、243～249號品種攜帶等位變異Ppd-B1a；9、217、220、222、228、230、232～235、242號品種攜帶等位變異Ppd-B1b；1～13、15～17、19～32、35～38、 40～52、54～61、63～72、76～80、82～88、91～120、122～125、127～205、207～249號品種攜帶等位變異Ppd-A1a；14、18、33～34、39、53、62、73～75、81、89～90、121、126、206號品種攜帶等位變異Ppd-A1b。

1-5, 7-8, 10-11, 13-23, 25-26, 29-47, 49-50, 52, 54-66, 68-72, 76-84, 86-115, 117-118, 120-125, 127-129, 131-136, 138-139, 141-144, 146-152, 154-159, 161-171, 173-210, 212-214, 216-233, 235-241, and 243-249 varieties carry the allelic variationPpd-D1a;6, 9, 12, 24, 27-28, 48, 51, 53, 67, 73-75, 85, 116, 119, 126, 130, 137, 140, 145, 153, 160, 172, 211, 215, 234, and 242 varieties carry the allelic variationPpd-D1b;1-8, 10-216, 218-219, 221, 223-227, 229, 231, 236-241, and 243-249 varieties carry the allelic variationPpd-B1a; 9, 217, 220, 222, 228, 230, 232-235, and 242 varieties carry the allelic variationPpd-B1b; 1-13, 15-17, 19-32, 35-38, 40-52, 54-61, 63-72, 76-80, 82-88, 91-120, 122-125, 127-205, and 207-249 varieties carry the allelic variationPpd-A1a; 14, 18, 33-34, 39, 53, 62, 73-75, 81, 89-90, 121, 126, and 206 varieties carry the allelic variationPpd-A1b.

2.3 光周期基因等位變異組合的分布頻率

青海和西藏小麥品種中共存在6種光周期基因等位變異組合類型，每種等位變異組合類型的平均分布頻率不同。等位變異組合Ppd-D1a/Ppd-B1a/Ppd-A1a出現(xiàn)的頻率最高，平均為 81.12%；其余幾種類型的分布頻率較低，都在10%以下(表4)。

青海小麥品種中存在5種等位變異組合類型，以Ppd-D1a/Ppd-B1a/Ppd-A1a類型為主(占 82.24%)，其余類型的出現(xiàn)頻率都在10%以下。青海和西藏農(nóng)家品種中的等位變異組合類型也存在差異，青海農(nóng)家品種中存在3種等位變異組合類型，以Ppd-D1a/Ppd-B1a/Ppd-A1a類型為主(占95.24%)；西藏農(nóng)家品種中存在4種等位變異組合類型，但也以Ppd-D1a/Ppd-B1a/Ppd-A1a類型為主(占65.71%)。

表4 光周期顯性等位變異組合在青海不同麥區(qū)的分布比例Table 4 Distribution of dominant allele combinations at photoperiod gene loci in Qinghai and Tibet wheat zones %

1～5、7～8 、10～11、13、15～17、19～23、25～26、29～32、35～38、40～47、49～50、52、54～61、63～66、68～72、76～80、82～84、86～88、91～115、117～118、120、122～125、127～129、131～136、138～139、141～144、146～152、154～159、161～171、173～205、207～210、212～214、216、218～219、221、223～227、229、231、236～241、243～249號品種具有Ppd-D1a/Ppd-B1a/Ppd-A1a組合類型；6、12、24、27～28、48、51、67、85、116、119、130、137、140、145、153、160、172、211、215號品種具有Ppd-D1b/Ppd-B1a/Ppd-A1a組合類型；9、234、242號品種具有Ppd-D1b/Ppd-B1b/Ppd-A1a組合類型；53、73～75、126號品種具有Ppd-D1b/Ppd-B1a/Ppd-A1b組合類型；14、18、33～34、39、62、81、89～90、121、206號品種具有Ppd-D1a/Ppd-B1a/Ppd-A1b組合類型；217、220、222、228、230、232、233、235號品種具有Ppd-D1a/Ppd-B1b/Ppd-A1a組合類型。

1-5, 7-8, 10-11, 13, 15-17, 19-23, 25-26, 29-32, 35-38, 40-47, 49-50, 52, 54-61, 63-66, 68-72, 76-80, 82-84, 86-88, 91-115, 117-118, 120, 122-125, 127-129, 131-136, 138-139, 141-144, 146-152, 154-159, 161-171, 173-205, 207-210, 212-214, 216, 218-219, 221, 223-227, 229, 231, 236-241, and 243-249 varieties havePpd-D1a/Ppd-B1a/Ppd-A1acombination type; 6, 12, 24, 27-28, 48, 51, 67, 85, 116, 119, 130, 137, 140, 145, 153, 160, 172, 211, and 215 varieties havePpd-D1b/Ppd-B1a/Ppd-A1acombination type; 9, 234, 242 and varieties havePpd-D1b/Ppd-B1b/Ppd-A1acombination type; 53, 73-75, and 126 varieties havePpd-D1b/Ppd-B1a/Ppd-A1bcombination type; 14, 18, 33-34, 39, 62, 81, 89-90, 121, and 206 varieties havePpd-D1a/Ppd-B1a/Ppd-A1bcombination type; 217, 220, 222, 228, 230, 232, 233, and 235 varieties havePpd-D1a/Ppd-B1b/Ppd-A1acombination type.

3 討 論

青海和西藏屬于我國十大麥區(qū)之一的青藏春冬兼播麥區(qū)[17]，雖屬同一麥區(qū)，但兩地的農(nóng)家品種中光周期等位變異及組合類型分布存在一定差異。青海農(nóng)家品種光周期不敏感型等位變異以Ppd-B1a占主導地位，Ppd-D1a和Ppd-A1a次之；西藏農(nóng)家品種中光周期不敏感型等位變異以Ppd-A1a占主導地位，Ppd-D1a次之，Ppd-B1a最低。此研究結果與楊芳萍[18]、韓領鋒等[19]的研究結果略有不同，可能與青海、西藏特殊的地理環(huán)境及氣候有關，作物可以通過生理生化等變化協(xié)調(diào)自身的生長發(fā)育以適應不同的環(huán)境[20]，因此，同一種質(zhì)的基因和不同環(huán)境的互作導致植物產(chǎn)生不同的基因型和表現(xiàn)型。青海和西藏位于青藏高原腹地，緯度高、氣溫低、光照時間長，對光周期反應較敏感的小麥品種適應這種環(huán)境，以防止過早的形成花原基提前開花遭受霜凍[21]。兩地農(nóng)家品種共同擁有Ppd-D1a/Ppd-B1a/Ppd-A1a、Ppd-D1b/Ppd-B1a/Ppd-A1a組合類型，青海農(nóng)家品種中還含有Ppd-D1a/Ppd-B1a/Ppd-A1b，西藏農(nóng)家品種中另含Ppd-D1b/Ppd-B1b/Ppd-A1a和Ppd-D1a/Ppd-B1b/Ppd-A1a。兩地農(nóng)家品種中各自擁有的等位變異組合類型的品種在農(nóng)藝形狀上表現(xiàn)及與敏感性有何關系有待進一步研究。

光周期反應對品種的適應性有重要影響，本研究結果表明，隨著種質(zhì)資源的交流，越來越多的育成品種含有光周期不敏感基因，對光周期敏感性降低。只有在青海柴達木盆地超高產(chǎn)區(qū)(超長、超強光照條件)培育的品種(柴春901、高原465、高原466等)，對生態(tài)條件具有特殊的要求，因此對光周期要求嚴格一些。

雖然多數(shù)品種以攜帶光周期不敏感型等位變異為主，無論是青海本土品種還是引進品種亦或是本土品種和引進品種雜交選育的育成品種及高代品系，光周期等位變異均以Ppd-B1a居多，推測這對青海育成品種的適應性有一定的限制。另外，生產(chǎn)實踐表明，青海由于生態(tài)環(huán)境多樣，地理條件和氣候千差萬別，為了保證一定產(chǎn)量，在育種中多選用高稈、大穗、高粒重材料，這些材料在我國其他麥區(qū)的氣候條件很難得到滿足，這也是高原小麥難以擴展的原因之一。本研究也推測出光周期反應可能不是影響青海和西藏小麥品種適應性強弱的主要原因，對于這一地區(qū)高產(chǎn)小麥品種難以大面積推廣的原因還值得進一步深究。今后，青藏高原小麥育種中應該加強品種的引進，增加品種的多樣性，以期提高小麥的適應性。