小麥穗發芽抗性分析及相關分子標記檢測

蘇在興，高閏飛,2，易 媛，王 波，常 勇，黃忠勤，周興根

(1.江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所，江蘇徐州 221131；2.中國農業科學研究院甘薯研究所，江蘇徐州 221131)

小麥收獲期若遭遇連陰雨或高溫高濕天氣，容易發生穗發芽現象(pre-harvest sprouting,PHS)，也叫胚萌[1]。穗發芽消耗了籽粒積累的生物質，直接影響小麥的產量、品質以及商用種子質量等，是世界性的自然災害[2-3]。我國北方冬麥區、長江中下游及西南麥區和東北春麥區經常受到穗發芽影響[4]，因而抗穗發芽小麥新品種的選育一直是我國小麥育種家高度關注的問題。

小麥穗發芽是基因型與環境互作的結果，影響小麥穗發芽的因素很多，包括種子休眠特性、吸水能力、α-淀粉酶活性[5]、種子萌發時儲藏物的降解速率、脫落酸及赤霉素的水平、種皮顏色、穗部含水能力和易干燥程度、收獲期降水及田間溫度、濕度等因素[3]。其中小麥種子的休眠特性是影響其穗發芽抗性的關鍵因素。

小麥的抗穗發芽特性是由多基因控制的數量性狀[6]，研究者將紅麥Zen的紅粒控制基因R、MFT及QPhs-5ALQTL導入硬粒小麥構建了近等基因系(near isogenic lines,NILs)，獲得發芽率(percentage germination,PG)和萌發指數(germination index,GI)均較低的硬粒小麥資源[7]。 Vp1是調節小麥休眠的重要轉錄因子，對小麥種子的休眠和抗穗發芽能力具有重要作用，其中STS標記Vp1B3在小麥抗穗發芽基因型鑒定中能擴增出849 bp(Vp1Bb抗穗發芽型)、569 bp(Vp1Bc抗穗發芽型)和652 bp(Vp1Ba感穗發芽型)三種帶型，能對抗穗發芽小麥種質資源進行一定程度的區分[8-10]。除上述幾個基因外，在3A、4A染色體上廣泛存在控制穗發芽抗性的位點，這些位點已被開發為分子標記，如：XBarc321、XBarc310、Xgwm397和Xgwm269等[11]。

應用抗穗發芽相關的分子標記，結合田間性狀調查和穗發芽試驗，可獲得抗穗發芽的優質品種和育種親本。本單位利用淮麥20與矮抗58的雜交F1代與淮麥20回交后經多年系統選擇得到中抗穗發芽小麥新品種徐農029。本研究擬通過整穗發芽法、籽粒發芽法和穗發芽相關分子標記探究徐農029及另外4個在黃淮冬麥區大面積推廣小麥品種的穗發芽抗性，為后續的育種研究及生產推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取黃淮冬麥區大面積推廣的矮抗58、淮麥20、周麥18、煙農19和中抗穗發芽小麥新品種徐農029為供試材料，于2017-2018年種植于徐州農業科學院試驗田，正常田間管理。其中淮麥20(♀)和矮抗58(♂)為徐農029的親本。

1.2 方 法

1.2.1 整穗發芽率測定

在小麥成熟期，每品種隨機選取10個大小基本一致的麥穗，2次重復。在實驗室用自來水沖洗0.5 h后，去除多余水份，用吸水紙覆蓋，置于種子發芽盒中，在18 ℃發芽箱中培養；每天噴水2次，保證吸水紙濕潤；3 d后取出麥穗，于60 ℃烘箱烘烤過夜，阻止進一步發芽；手工脫粒；以籽粒胚部種皮破裂為穗發芽鑒定標準[1]，調查小麥的整穗發芽率(spike germination rate,SGR)。整穗發芽率=發芽籽粒數/籽粒總數×100%[12]。

1.2.2 籽粒發芽率和萌發指數測定

每個品種隨機選取50穗成熟一致的麥穗，脫粒并充分混合。隨機選100粒混合樣種子，腹溝朝下整齊排列于墊有吸水紙的發芽盒中，分別于正常溫度(18 ℃)和低溫(5 ℃)處理3 d后均轉入18 ℃條件下培養。以籽粒胚部種皮破裂為穗發芽鑒定標準[1]，每天定時記錄發芽種子數。于第7天計算發芽率和萌發指數。3次重復。

發芽率=發芽籽粒數/100×100%[12]；

萌發指數=(7×n1+6×n2+5×n3+4×n4+3×n5+2×n6+1×n7)/( 7×總籽粒數)×100%，其中n1、n2、…、n7為第1至第7天每天發芽的小麥籽粒數[13]。

1.2.3 小麥基因組DNA提取及PCR擴增

采用柴建芳[14]的方法提取小麥的DNA。選取10個與穗發芽抗性相關的分子標記(表1)，引物由上海生工公司合成。PCR反應體系為20 μL，康為2×Taq Mix混合液10 μL，10 mmol·L-1的正反引物各1 μL，50 ng·μL-1的DNA 模板1 μL，7 μL ddH2O。PCR擴增程序為 94 ℃預變性3 min; 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min; 4 ℃保持。用6%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測[15]。

表1 小麥穗發芽抗性相關分子標記Table 1 Molecular markers associated with PHS in wheat

1.3 數據處理

用Office 2013進行數據整理及繪圖，用SPSS 21.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 整穗發芽率分析

對5個小麥品種進行整穗發芽率分析發現，煙農19的整穗發芽率最高，達68.80%；其次為周麥18，為26.76%；矮抗58、淮麥20和徐農029的整穗發芽率分別為7.05%、8.90%和3.02%。方差分析表明，品種對整穗發芽率有顯著(P< 0.05)影響。多重比較發現，煙農19的整穗發芽率顯著高于其他4個品種；周麥18的整穗發芽率顯著高于矮抗58、淮麥20和徐農029；矮抗58、淮麥20和徐農029的整穗發芽率差異不顯著 (圖1)。

圖柱上不同字母表示品種間差異在0.05水平上顯著。

Different letters above bars indicate significant difference among the five cultivars at 0.05 level.

圖1 整穗發芽率

Fig.1Spike germination rate(SGR) of the five cultivars

2.2 籽粒發芽率分析

2.2.1 正常溫度條件下的發芽率

由表2可知，持續18 ℃培養，不同小麥品種間的發芽率和萌發指數的差異程度不同。徐農029的發芽率和萌發指數分別為41.00%和 21.43%，均極顯著低于其親本矮抗58(71.67%、 53.10%)和淮麥20( 89.67%、61.00%)，周麥18和煙農19的發芽率均為99.33%，煙農19的萌發指數高于周麥18，但差異不顯著。

2.2.2 低溫處理后的發芽率

5 ℃處理3 d后，徐農029的發芽率達 93.67%，較持續18 ℃提高了52.67%；矮抗58和淮麥20的發芽率分別為88.00%和99.33%，較持續18 ℃提高了16.33%和9.67%；低溫對周麥18和煙農19的發芽率影響不明顯(表2)。低溫處理提高了徐農029的萌發指數，但降低了其余四個品種的萌發指數。

2.2.3 小麥種子發芽動態分析

持續18 ℃條件下，煙農19、周麥18和矮抗58種子能迅速啟動發芽過程，2 d內發芽率達到較高水平，第4天煙農19和周麥18的發芽率分別達93.7%和96.7%；淮麥20的發芽啟動較矮抗58晚，第4天時其發芽率為82.0%，而矮抗58的發芽率為68.0%；此時徐農029的發芽率僅 24.3%。第8天煙農19和周麥18的發芽率達到最高，分別為99.3%和99.7%；淮麥20、矮抗58和徐農029的發芽率分別為94.0%、73.0%和 45.0%；第14天，后3個品種的發芽率分別增加了4.3%、6.0%和2.0%(圖2)。

表2 不同溫度處理下各品種的發芽率和萌發指數Table 2 Percentage germination(PG) and germination index(GI) of the five cultivars with different temperature %

同列數據后不同字母表示品種間差異在0.01水平顯著。

Different letters following values in same column indicate significant difference among cultivars at 0.01 level.

圖2 正常溫度條件下各品種的發芽率動態

經5 ℃低溫處理，第4天煙農19的發芽率達100%，較持續18 ℃的發芽率提高了6.3%，周麥18的發芽率不變，淮麥20、矮抗58和徐農029的發芽率均有所提高。第8天煙農19和周麥18的發芽率均為100.0%；淮麥20、矮抗58和徐農029的發芽率分別提高了6.0%、18.0%和 53.3%，徐農029的發芽率達到98.3%。第14天，淮麥20、矮抗58和徐農029的發芽率分別為100.0%、94.3%和98.3%。說明低溫處理可提高種子的發芽率(圖3)。

圖3 低溫處理后各品種兩周內發芽率動態

2.3 分子標記檢測

就Vp1B3標記而言，煙農19、徐農029和淮麥20擴增得到569 bp的條帶，屬于Vp1Bc型抗穗發芽；周麥18和矮抗58擴增得到652 bp的條帶，屬于Vp1Ba型感穗發芽，沒有發現845 bp的條帶。Xgwm282在5個品種中呈現2種帶型，矮抗58、淮麥20和徐農029帶型相同，周麥18和煙農19呈另一種帶型，說明其能較好地區分抗穗發芽和穗發芽敏感的品種。MST101的擴增片段在400～750 bp之間，多態性比較豐富，5個品種呈現出5種不同的帶型，其中，徐農029幾乎綜合了其雙親矮抗58和淮麥20的各個條帶，但沒有共性。另外7個分子標記不能很好區分上述5個品種的抗穗發芽特性(圖4)。

M1:2 000 bp的marker；M2:500 bp的marker；各分子標記對應的品種從左至右依次為：矮抗58、淮麥20、徐農029、周麥18和煙農19。

M1:2 000 bp marker; M2: 500 bp marker; The order of cultivars(left to right) corresponding to each molecular marker is Aikang 58,Huaimai 20,Xunong 029,Zhoumai 18 and Yannong 19.

圖4 穗發芽抗性相關分子標記檢測

Fig.4 Detection with 10-pair molecular markers associated with PHS resistance

3 討 論

穗發芽在世界范圍內較為普遍，是影響小麥產量和品質的重大災害之一。目前，黃淮麥區大面積種植的周麥18、煙農19等品種不具有穗發芽抗性，生產上存在一定的風險性[21]。本試驗發現，矮抗58和淮麥20具有較強的穗發芽抗性，周麥18和煙農19不抗穗發芽，與苗西磊等[12]、張兆萍等[3]、簡俊濤等[22]、趙 斌等[21]、張秀英等[23]的報道基本一致。就整穗發芽率、籽粒發芽率而言，徐農029的抗穗發芽能力優于其親本矮抗58和淮麥20，在生產上具有較好的推廣應用前景。

整穗發芽試驗可模擬小麥收獲期田間的溫濕環境，沈正興等[24]、苗西磊等[12]研究表明，不同基因型的小麥穎殼、穗軸或它們的分泌物可能對籽粒的發芽有一定的控制作用。籽粒發芽試驗能較好的分析小麥品種之間籽粒的休眠特性，具有較高的實用性。在記錄穗發芽時，有以胚部出現破裂跡象即為穗發芽的[1,25]，有以芽長達到種子長度一半記為穗發芽的[17]，本研究采用籽粒種皮破裂記為穗發芽。相關學者在抗穗發芽分子標記方面已進行了大量的探索，開發出一定數量的分子標記，如STS標記Vp1B3[13]、MST101[26]和SSR標記Xgwm155[27]wmc104[26]等。上述三種方法的結合在尋找抗穗發芽種質資源和后備材料的抗性分析方面發揮重要作用。本試驗發現，選取的10個穗發芽抗性相關分子標記中，Vp1B3和Xgwm282和穗發芽抗性關系較密切，其他標記不能區分5份供試材料的穗發芽抗性，其原因可能與開發相關分子標記所用材料的基因型背景不同有關。

種子產生休眠的原因具有多樣性，故解除其休眠的方法也不同。前人研究表明，可采用低溫或高溫、射線、超聲波等能改善種殼透性的物理處理以及激素、H2O2或強酸強堿等化學試劑破除種子的休眠[28]。本試驗采用低溫處理打破供試材料的休眠性，并對兩周內種子的發芽動態進行了分析，持續18 ℃條件下，徐農029在14 d時發芽率僅47%；經5 ℃低溫處理3 d后，其發芽率達98.3%，說明發芽率主要由種子的休眠特性決定。

前人應用Vp1B3標記在篩選小麥抗穗發芽品種(系)方面已進行了大量的研究[8,12,29]，也有研究者認為，該基因的等位變異與穗發芽抗性關系不密切[30]。苗西磊等[12]研究表明，矮抗58屬于Vp1Ba基因型，該基因型與感穗發芽相關，但矮抗58屬中抗穗發芽品種，其抗性可能與穗軸有關。本研究中，徐農029、淮麥20和煙農19均擴增得到569 bp(Vp1Bc型抗穗發芽)的條帶，但煙農19的分子標記結果與穗發芽試驗結果不符合。周麥18和矮抗58擴增得到652 bp(Vp1Ba型感穗發芽)的條帶，前人的研究中也存在此類情況[8,12]。穗發芽抗性機制比較復雜，分子標記檢測結果與穗發芽抗性不符合可能與標記與抗性基因連鎖性不緊密或供試材料的遺傳背景不同有關，需進一步深入研究。