云貴川湖泊芽孢桿菌分離、鑒定及抗動物病原菌活性研究

張君利，劉超蘭，郭義東，林家富

(成都大學四川抗菌素工業研究所，抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，成都610052)

近年來，由于畜禽行業抗生素的過度使用，細菌耐藥性不斷增強，使中國成為世界上動物源性細菌耐藥性最嚴重的國家之一(胡燕等，2013)。臨床分離的畜禽常見病原菌(大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、巴氏桿菌Pasteurella、沙門氏菌Salmonella、肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa等)可耐受抗菌藥物達5～20種，引起了人們對動物疾病防治的高度重視。與此同時，60%以上的人體病原菌來自動物。一些人畜共患病原菌特別是食源性病原菌的出現，也對我國的動物源食品安全和公眾健康構成了嚴重威脅(Theuretzbacher，2013)。原有病原菌抗耐藥情況還未緩和，新病原菌抗耐藥又不斷出現，促使人類尋找新型抗生素和抗菌藥物(Olga，2017)。目前已有的生物活性物質基本是從土壤放線菌中獲得的(譚悠久等，2011)。但是，由于陸地資源的過飽和挖掘，使得發現更多新化合物和新菌種越來越難。因此，人們開始把海洋、湖泊、極端環境、植物內生等作為新的研究對象，以期利用新的生長環境獲得新的微生物資源，提高新化合物及活性化合物的發現幾率。

本課題組前期從云貴川地區的9個湖泊沉積物中分離出244株菌，鑒定為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、厚壁菌門Firmicutes以及異常球菌-棲熱菌門Deinococcus-Thermus 4個門，芽孢桿菌屬Bacillus、鏈霉菌屬Streptomyces和庫特氏菌屬Kurthia等24屬。經過菌株的活性初篩，發現芽孢桿菌屬活性較好。因此，本文將從湖泊沉積物芽孢桿菌的分離、鑒定及抗動物病原菌活性評價等方面進行闡述，為利用湖泊來源的芽孢桿菌及其脂肽類抑菌物質、進一步開發抗動物病原菌的新型微生物藥物提供菌種資源和理論依據。

1 材料與儀器

1.1 樣品來源

對云貴川地區的9個湖泊進行深度采樣，每個湖泊采集1份水體沉積物樣品(表1)，密閉的50 mL離心管保存于冰盒，72 h內送至實驗室培養。

1.2 主要儀器和試劑

PCR擴增儀(Bio-Rad，美國)；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器(申安，上海)；ZF-20D暗箱式紫外分析儀(遠懷，上海)；超凈工作臺(安泰，蘇州)；電子生化培養箱(東聯，哈爾濱)；1200系列液相色譜-質譜聯用儀(Agilen，美國)；LC-20AD液相色譜儀(島津，日本)；實驗室其他常規儀器。

TIANGEN酵母基因組DNA提取試劑盒；2×TSINGKE Master Mix，10×Loading Buffer；DL2000DNA Maker；標準品98%surfactin，90%iturin(Sigma)；其他試劑均為分析純。

表1 樣品信息Table 1 Sampling information

1.3 培養基

分離培養基：LB瓊脂培養基和海洋(2216E)培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司；發酵培養基：LB肉湯培養基；動物病原菌培養基：LB瓊脂培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.4 動物病原菌

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌Candidaalbicans均由四川抗菌素工業研究所菌保中心提供。

2 實驗方法

2.1 菌株分離純化

使用稀釋涂布法分離菌株：首先將沉積物樣品放置于超凈工作臺，過夜風干，稱取2 g，加入18 mL滅菌蒸餾水，震蕩2 h。其次將混懸液梯度稀釋至10-1～10-6，分別取100 μL懸濁液均勻涂布于營養瓊脂平板，37 ℃培養48 h。根據菌落質地、大小、顏色和光澤等特征，挑取形態差異明顯的單菌落。最后重復2～3次，鏡檢，將已純化的菌株于25%甘油中-80 ℃保存。

2.1.1 形態特征菌株在37 ℃的LB培養基中生長48 h后，將細菌細胞懸浮在0.85%(w/v)的NaCl溶液中，在鍍鎳網上加熱干燥，并用磷鎢酸染色，使用電子顯微鏡觀察細胞的大小和形態；通過懸滴法(Bowman，2000)檢測細胞的運動能力；通過革蘭氏染色法(Smibert，1994)鑒別菌株。

2.1.2 生理生化特征溫度：將實驗菌株接種到LB固體培養基，在不同的溫度(4～50 ℃，間隔5 ℃)下培養，此外，在28 ℃和37 ℃培養菌株，確定最適生長溫度和范圍。pH：將30 ℃條件下培養好的菌株接種到不同pH值(pH=5～11，間隔0.5)的LB液體培養基中培養3～5 d，觀察菌株的生長情況，測定菌株在OD600時的吸光度，以確定最適生長pH及范圍。鹽度耐受：在LB固體培養基上分別添加不同濃度的NaCl(范圍0～10%，間隔1%)(w/v)檢測菌株對NaCl的耐受程度。酶學特征：過氧化氫酶活性、氧化酶活性測定參考Cui等(2001)的方法。吲哚、明膠、七葉苷的實驗均參考細菌系統鑒定手冊。

2.2 菌株16S rRNA基因序列測定及系統發育分析

通過DNA試劑盒提取基因組DNA。采用 20 μL反應體系進行PCR擴增，即DNA模板2 μL，2×TSINGKE Master Mix 10 μL，27F(10 μmol·L-1)1 μL，1492R(10 μmol·L-1)1 μL，超純水6 μL。27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)為細菌通用引物。PCR擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，通過Bio-Rad凝膠成像儀觀察電泳結果。

PCR擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，將所得各菌株16SrRNA基因序列通過NCBI數據庫進行Blast比對，以相似性較高的標準菌株的16SrRNA序列作為參照對象進行種屬菌屬分類。根據菌株比對結果，采用MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)以鄰接法(Neighbor-Joining)(Saitou &Nei，1987)構建系統發育樹。分析各湖泊之間的菌種分布以了解不同環境之間、不同種之間、環境與種之間的關系。

2.3 菌株發酵及抗菌活性檢測

用接種環挑取斜面培養基上已純化菌株的適量菌體接種于裝有40 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中，置于30 ℃、200 r·min-1的搖床培養2～3 d。離心取上清，加濃鹽酸調至pH2，沉淀過夜。12 000 r·min-1、30 min，離心去上清，向沉淀中加入2 mL甲醇溶解，最后過0.22 μm微孔濾膜，將甲醇浸提液通過減壓濃縮至蒸干，然后稱重，并將粗提物用甲醇再次溶解配置成10 mg·mL-1的母液備用。使用動物病原菌進行抗菌活性檢測。

采用濾紙片抑菌圈法對菌株進行抗菌活性檢測。分別將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌接種于LB液體培養基中，白色念珠菌接種于PDA液體培養基中，置于37 ℃、180 r·min-1的搖床上培養18 h，獲得種子液。在超凈工作臺中，分別吸取100 μL種子液加入到45 ℃左右的100 mL的LB瓊脂培養基和PDA培養基中，搖勻后倒平板。待平板凝固后，分別將含有約10 μL粗提物母液的滅菌濾紙片(直徑8 mm)以合適的間距放置于平板上，每組設置3個平行試驗。于37 ℃培養24 h，同等條件下設置空白對照，觀察有無透明圈并記錄大小。

2.4 活性菌株次級代謝產物的LC-MS分析

對粗提物和配制成1 mg·mL-1的標準品進行LC-MS檢測，參照標準品對次級代謝產物的活性成分進行分析。液相色譜條件為C18-MS-Ⅱ(2.6 mmφ×250 mm，TSK)；進樣量20 μL；柱溫25 ℃；流動相為(A)乙腈和(B)水。洗脫條件為：0～10 min，A 20%～50%，B 80%～50%；10～50 min，A 50%～65%，B 50%～35%；50～60 min，A 50%～65%，B 50%～35%；流速0.6 mL·min-1。紫外檢測波長為210 nm。

質譜條件為：ESI電噴霧；正離子模式；霧化氣壓力1.0×105Pa；毛細管電壓3 500 V；氮氣干燥，流速為10 L·min-1，250 ℃；掃描范圍300～1 800 m/z。

3 結果及分析

3.1 菌株分離鑒定

菌株的表型特征顯示，芽孢桿菌是一種短桿狀、無莢膜、能運動的革蘭氏陽性細菌，菌落呈光滑圓形、不透明、乳白色。生理生化特征顯示其在pH為6～8，溫度為25～37 ℃，NaCl濃度為0～5%的培養條件下生長良好，屬于嚴格好氧或兼性厭氧菌；細胞大小為0.3～2.2 μm×2.1～7.0 μm。其中，多數菌株的VP顯示陽性；氧化酶和過氧化氫酶呈陽性；七葉苷、明膠水解，不產生吲哚(表2、表3)。

表2 菌株的表型特征Table 2 Phenotypic characteristics of strains

3.2 菌株16S rRNA基因序列測定及系統發育分析

3.2.116SrRNA測序分類使用上述處理方法根據菌落表型特征和16S rRNA鑒定，共分離得到47株芽孢桿菌，有26種，最多的為漳州芽孢桿菌Bacilluszhangzhouensis(7株)，食丁酸芽孢桿菌Bacillusbutanolivorans和海口芽孢桿菌Bacillushaikouensis各4株，高地芽孢桿菌Bacillusaltitudinis3株，其余各種為2株或1株(表4)。

3.2.2 系統發育分析47株芽孢桿菌自聚類分析(圖1)顯示，首先，各湖泊沉積物樣品中所分離出的菌株分別聚為一簇，說明同一環境中的菌株之間親緣關系相近；而不同地區的菌株大不相同，說明地區之間可能由于氣候和經緯度差異，造成微生物種群差異。其次，菌株SIIA-Z556、SIIA-Z842、SIIA-Z530、SIIA-Z537和SIIA-Z531均來自邛海，且聚為一簇，可靠度達78%，同源性較高。菌株SIIA-Z858、SIIA-Z656、SIIA-Z665和SIIA-Z573均來自瀘沽湖，且聚為一簇，可靠度高達100%，同源性非常高，進化關系極為相近，說明同一生境更易產生親緣關系相近的菌種。最后，來自洱海的菌株SIIA-Z536、來自紅楓湖的SIIA-Z582與邛海分離出的菌株SIIA-Z556、SIIA-Z842、SIIA-Z537、SIIA-Z530、SIIA-Z531均屬漳州芽孢桿菌，說明不同環境可以產生相同菌種。可見湖泊生境對于微生物多樣性研究有著重要意義。

表3 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains

3.3 發酵產物對病原菌的活性研究

采用瓊脂擴散法對47株菌株發酵粗提物進行抗菌活性篩選(表5)。結果顯示，共13株發酵粗提物對動物病原菌顯示出抗菌活性。其中，對金黃色葡萄球菌顯示出抗菌活性的菌株較多，有10株，對白色念珠菌有抗菌活性的5株，對大腸桿菌有抗菌活性的4株，而對銅綠假單胞菌顯示出抗菌活性的僅2株。為明確活性化合物種類，將進一步對活性菌株的發酵粗提物進行LC-MS分析。

3.4 活性菌株代謝產物的LC-MS分析

對13株有抗菌活性菌株的發酵粗提物進行LC-MS分析，結果表明，芽孢桿菌所產生活性化合物主要為脂肽類。通過LC-MS檢測到4種不同的質譜峰，各活性特征峰的分子量及根據質荷比推斷產物歸屬類別如表6所示。發酵粗提物中，檢測到surfactins質子峰的芽孢桿菌9株，均為C13～C15的surfactins質子峰，m/z=1 007.9、1 023.4和1 037.7，為相差1個亞甲基(-CH2-)的同系物；檢測到fengycins質子峰的芽孢桿菌5株，均為C15、C16的fengycins質子峰，m/z=1 449.3和1 464.9，也為相差1個亞甲基(-CH2-)的同系物；檢測到iturins質子峰的芽孢桿菌6株，其中，bacillomycin L質子峰4株，bacillomycin D質子峰2株。分析發現，有14株產表面活性素類抗菌脂肽的芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌或大腸桿菌有抑菌活性，有2株產豐原素類抗菌脂肽的芽孢桿菌對銅綠假單胞菌有抑菌活性，有5株產伊枯草素類抗菌脂肽的芽孢桿菌對白色念珠菌有抑菌活性。

表4 湖泊沉積物中分離的芽孢桿菌種類Table 4 Species of Bacillus isolates from different lake sediments

4 討論

芽孢桿菌可產生多種抗菌物質，其中大部分為脂肽類化合物，脂肽屬于非核糖體肽，而非核糖體肽是當前的研究熱點。目前，我國對抗菌脂肽的研究還不夠深入，即使在發達國家，也是一個新的領域。國內外對芽孢桿菌脂肽類化合物的研究大部分集中在抗真菌，尤其是抗植物病原真菌，只有少部分研究集中在抗細菌(李紅亞等，2017)，對抗動物病原菌的研究則更鮮有。

據報道，芽孢桿菌產生的脂肽類化合物有表面活性素家簇、伊枯草素家簇和豐原素家簇(Tsugeetal.，2001；Koumoutsietal.，2004；Moyneetal.，2004；Chenetal.，2006)。其中，iturins和fengycins作為農業生產中常見植物真菌疾病的生物防治藥(Romeroetal.，2004，2007；Luoetal.，2015)。Surfactins主要對細菌產生抑制作用(羅楚平等，2011；Zeriouhetal.，2011；Gordillo &Maldonado，2012；Meena &Kanwar，2015)。近年來，由于動物病原菌抗耐藥情況的日益嚴重，人們開始嘗試將芽孢桿菌脂肽類化合物用于動物病原菌的防治，效果顯著。已有研究表明，在畜禽生產中芽孢桿菌具有調節動物腸道菌群平衡、抑制動物病原菌、防治消化道疾病以及提高機體免疫力等作用(李紅亞等，2017)。在西方國家芽孢桿菌已被應用于人的功能性食品和動物飼料添加劑(葉小蘭，楊倩，2011)。與細菌素等抗菌物質相比，芽孢桿菌所產生的抗菌脂肽殺菌范圍更廣、效率更高、毒副作用更小、穩定性更好。此外，抗菌脂肽對血凝、病毒和腫瘤也有很好的抗性。綜上所述，由芽孢桿菌生產的脂肽類抗生素在農業、醫藥以及化妝品行業都具有巨大的應用前景(Aarrebolaetal.，2010)。

圖1 菌株基于16S rRNA基因序列分析構建的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic dendrogram constructed based on 16S rRNA gene sequences

國內外大多從土壤環境中分離產抗菌脂肽的芽孢桿菌，且研究對象多為單一菌株。本研究從湖泊沉積物中分離出47株芽孢桿菌，以4株常見動物病原菌為檢定菌進行活性檢測，篩選出13株活性菌株，LC-MS技術對13株芽孢桿菌發酵產物的分析顯示，有3種脂肽類抗生素，分別為表面活性素、伊枯草素和豐原素。活性檢測表明，脂肽類抗生素對動物病原菌有顯著的抗菌活性。本研究為豐富特殊生境中芽孢桿菌資源在畜禽疾病控制方面的研究提供了新的菌種資源。

表5 芽孢桿菌次級代謝產物對動物病原菌的抗菌活性Table 5 Antimicrobial activity of Bacillus submetabolites against animal pathogens

注：+有抑菌活性，-無抑菌活性
Notes：+bacteriostatic activity，-no bacteriostatic activity

表6 活性芽孢桿菌菌株的LC-MS分析Table 6 LC-MS analysis of active Bacillus strains