急性缺血條件下的動物腦部電阻抗特性變化規律的實驗研究

周怡敏，陳真輝，史學濤，亢君君，付峰

空軍軍醫大學 a. 軍事生物醫學工程學系；b. 基礎醫學院，陜西 西安 710032

引言

最新數據表明，全世界每隔6 s 就有一人死于腦卒中[1]。近年來，腦卒中已成為我國單一器官致死原因的第一位[2]。由于中樞神經組織細胞的脆弱性和不可再生性，腦卒中發生后會在很短的時間內造成不可逆的腦功能損傷，因此早發現、早治療是提高腦卒中救治效果、降低殘死率的關鍵[3]。同時，腦卒中分為腦出血和腦梗這兩種完全不同類型，這兩類腦卒中不僅治療措施完全相反（腦梗需要盡早溶栓治療，而腦出血則著重需要止血），腦梗患者更是具有因缺血血管壁變性而引發進一步腦出血的風險[4]，因而腦卒中的超早期正確診斷及對其病程的實時動態監測對于臨床救治意義重大。

以CT、MRI 為代表的現代醫學影像技術主要以組織的器質性變化為基礎，雖然對腦出血具有較高的敏感性，但對超早期、尚未形成明顯壞死的腦缺血性病變則不夠敏感，往往需要等到細胞發生明顯變性，達到不可逆壞死階段才能體現，無法在有效治療時間窗內提供準確信息，更無法滿足病程發展的實時監測要求[5-6]。電阻抗成像（Electrical Impedance Tomography，EIT）技術是一種實時、無創、安全的功能性成像技術，以目標電阻率變化或電阻抗分布進行成像，由于腦組織受到損傷后，血腦屏障被破壞或者細胞膜的離子通道功能異常都會引起導電性溶液在血液、細胞間質、細胞內的分布平衡被打破，這些不僅會導致腦組織的功能性病變，細胞膜內外的電阻抗特性也均會產生相應變化。同時在病變發展的不同階段，病變組織及細胞的變化程度都有差異，電阻抗特性也會有相應的變化[7-11]。

國內外研究團隊針對腦損傷組織的電阻抗特性開展了大量的研究工作，Horesh 等[12]的研究結果表明在1 kHz 以下，腦卒中組織的電阻抗顯著高于正常組織；Lingwood 等[13]的報道也顯示缺血缺氧后腦部電阻抗會明顯上升；Harting等[14]也研究了大鼠腦損傷后的腦部電阻抗在500～5000 Hz頻率段內的變化特性。Dowrick 等[15]也發現在0～250 Hz 頻率范圍內，正常和受損腦組織的電阻抗隨頻率的升高都有所降低，但是降低幅度有顯著性差異。雖然近期的研究均表明腦損傷后腦組織的電阻抗特性會發生顯著性變化，但由于各自的研究目標方面的差異，這些研究在腦損傷模型選擇、電阻抗特性測量方法、所選擇的測量頻率范圍、采取的電阻抗特性分析方法方面都有著顯著的差異，得到的結果也不夠統一。目前，相關領域對缺血后的腦卒中組織的電阻抗變化規律仍缺乏清楚認識，也未見有關不同進程與發展狀態下的腦卒中組織電阻抗特性變化規律研究，導致生物電阻抗技術應用于臨床早期診斷監測缺血性腦卒中還有一定的差距。因此，本文希望通過對缺血病變腦組織與正常腦組織的電阻抗頻譜特性的對比研究，以及在病程發展的不同時間節點對腦卒中組織電阻抗的測量，認識缺血后的腦組織電阻抗特性變化規律，并尋求EIT 診斷監測早期腦卒中的最佳的頻率點，以提高EIT 的成像精度，從而實現缺血性腦卒中發展狀態的診斷與監測。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本實驗以雄性SD 大鼠（30 只）為實驗對象，均來自空軍軍醫大學動物實驗中心，體重（250±10）g（8 周齡），飼養溫度25℃±2℃，飼養時不控制大鼠的飲食。本研究中的所有動物實驗方案均經空軍軍醫大學動物倫理委員會的批準和支持。

1.2 儀器與方法

1.2.1 腦缺血動物準備及模型制備

所有動物術前禁食12 h，不禁水，使用10%的水合氯醛（3.5 mg/kg）對大鼠進行腹腔注射麻醉。于大鼠右側大腦顱骨鉆兩個直徑1 mm 的孔，深度以不破壞硬腦膜為準，插入牙科釘固定作為電極（圖1），以前囟為坐標原點，其右側與上方為正方向，則兩個電極的位置坐標分別為（3 mm，2 mm）、（3 mm，-8 mm），電極間距為1 cm。采用兩電極法在體測量大鼠腦組織缺血前后的電阻抗頻譜特性。

圖1 測量電極位置分布

腦缺血模型采用線栓法梗阻大腦中動脈（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO），造模過程如圖2a所示。大鼠仰臥位固定，在頸正中線偏右1 mm 處切口（1.5～2 cm），沿胸鎖乳突肌方向，小心剝離血管壁附近的迷走神經，依次分離右側頸總動脈（Common Carotid Artery，CCA）、頸外動脈（External Carotid Artery，ECA）和 頸 內 動 脈（Internal Carotid Artery，ICA）。 在CCA、ECA、ICA 的近心端各繞細線備用。待電阻抗數據測量開始后，結扎實驗組動物的CCA 和ECA 的近心端，然后在距離CCA 分叉口1～2 mm 處切口，將線拴插入ICA 中，深度控制為18 mm，梗阻右腦中動脈，扎緊預留的細線，最后縫合傷口。

圖2 MCAO模型制備及電阻抗頻譜特性測量

1.2.2 腦組織電阻抗頻譜特性測量

應用以Solartron1260 電阻抗分析儀和1294 生物電阻抗測量接口為核心的電阻抗頻譜測量平臺進行大鼠腦組織的電阻抗頻譜特性測量。測量頻率范圍為10 Hz～1 MHz，采用對數掃頻模式，每十倍頻十個點，共測61 個頻率點。

從實驗大鼠中隨機選取24 只為模型組，首先采集造模前的腦部電阻抗頻譜信息，隨后進行MCAO 造模，分別于造模完成后0.5、1、1.5、2、2.5、...6 h 測量并觀察動物腦部電阻抗變化特性。實驗過程中，采用10% 的水合氯醛以0.2 mL/ kg·h 的速率進行腹腔注射，以維持大鼠的麻醉狀態，同時用恒溫箱維持大鼠的體溫在37℃左右（圖2b）。

1.2.3 微觀形態學對照

采用相同方法對剩余6 只大鼠進行MCAO 造模，連續測量右腦電阻抗頻譜3 h，隨后將大鼠深度麻醉，使用2%多聚甲醛和2%戊二醛進行心臟灌注后取腦，采用透射電子顯微鏡分別觀察實驗動物左右側腦組織血腦屏障的完整性。

1.2.4 數據分析

使用SPSS 14.0 軟件對腦組織的電阻抗頻譜特性數據進行統計學分析，對缺血前后不同時間點的數據進行配對樣本t 檢驗分析。

2 結果

2.1 電阻抗變化規律

建立MCAO 模型后6 h 內，腦組織電阻抗數值與缺血前數據相比：缺血0.5 h 后阻抗值有所下降；但0.5～3 h 之間，電阻抗數值呈近似線性、快速上升；3～6 h 阻抗數值雖有增加但趨勢不明顯（圖3）。；由缺血前為對照不同頻率下的腦電阻抗相對變化率隨時間的變化曲線可見，腦阻抗在1、10 以及100 kHz 的頻率下的相對變化率較高（圖4）。

圖3 缺血6 h內不同頻率下的動物腦電阻抗隨時間變化曲線

圖4 相對缺血前的電阻抗變化率隨時間變化曲線

缺血前及缺血1、2 和3 h 腦電阻抗隨頻率的變化情況如圖5 所示。由圖5 可知，隨著頻率的上升，腦電阻抗整體呈下降趨勢，在1 MHz 的頻率下達到最低值。同時，從變化速率上看，在10～100 Hz 頻率范圍內，缺血后的阻抗隨頻率變化速率小于缺血前。

圖5 缺血前與缺血后3 h的電阻抗頻譜

2.2 微觀形態學結果

缺血3 h 后腦組織血腦屏障微觀結構如圖6 所示。由圖6a 可以看出，缺血3 h 后左腦灰質的微血管內皮細胞、星形膠質細胞終足和基底膜結構完整，間隙連接存在（黃色圓圈），表現為內皮細胞間深染的致密條帶；圖6b 是缺血3 h 后右腦灰質微血管超微結構的發展變化，可見血管內皮細胞較完整，間隙連接存在，但星形膠質細胞終足水腫明顯（箭頭），與微血管基底膜接觸的完整性破壞，基底膜增厚。

圖6 缺血3 h后腦組織血腦屏障微觀結構

3 分析與討論

腦卒中超早期檢測對于提升缺血性腦梗患者的臨床救治效果至關重要。生物EIT 技術依據腦組織電阻抗特性與組織功能狀態密切相關，有望實現此類疾病的超早期檢測。既往的研究中，已有部分學者對缺血后的腦組織電阻抗變化特性進行了觀察，如：Dowrick 等[15]研究發現在1 Hz～3 kHz 的頻率范圍內缺血比正常腦組織的阻抗值大；Wu 等[16]也報導了缺血與正常腦組織在低頻時的電阻抗差異最大。

由上述研究現狀可以看出，目前國際上對缺血后腦組織電阻抗變化規律并未明確，為提高EIT 技術對腦缺血早期檢測的敏感性，有必要開展進一步研究，以確定缺血后的腦組織電阻抗特性隨時間及頻率的變化特性，為進一步的成像檢測研究奠定基礎。為此，本研究系統的測量了腦缺血損傷后6 h 之內的阻抗頻譜變化，在多個時間點分析了缺血性損傷后的腦組織阻抗隨頻率的變化規律，并對缺血3 h 的阻抗變化與超微觀腦組織的結構進行了定性分析。

3.1 缺血后腦組織電阻抗隨時間的變化

與以往的研究工作不同，本研究在10 Hz～1 MHz 范圍內全面測量了缺血性腦損傷發生后6 h 內不同時間點的腦阻抗。從圖3 所示的各頻率下腦阻抗隨時間的變化結果可以看出，缺血后前半小時的腦部阻抗呈輕度下降，但在隨后的2.5 h 內呈快速、近似線性的上升變化，3～6 h 呈近似平臺樣變化。可明顯觀察到缺血3 h 是腦阻抗變化的拐點。此時，腦組織阻抗達到階段性的最高點，此后的阻抗變化相對平穩，提示這一時刻可能是缺血腦組織發生微觀層面變化的關鍵時期。同時依據腦阻抗隨時間的變化特性有望為腦缺血性損傷的程度評價提供支撐，從而為EIT 成像技術在超早期缺血性腦卒中的診斷和監測應用奠定基礎。

3.2 缺血后腦組織電阻抗隨頻率的變化

由圖5 可見，隨著頻率的升高，MCAO 造模前后腦組織的電阻抗數值都逐漸減小，且在頻率10～100 Hz 范圍內，隨著頻率的升高，缺血腦組織電阻抗隨頻率的下降速率小于正常腦組織。這與Dowrick 等[15]在體測量大鼠缺血腦組織的結論一致。

由于造模成功后缺血性損傷的腦組織阻抗值在3 h 達到階段性的最高點，為進一步分析此期間的腦阻抗變化規律，我們依據公式計算得出1、2、3 h 相對缺血前的阻抗相對變化率，結果如圖7 所示。可見缺血后1、2、3 h 的阻抗相對變化率隨頻率呈非線性變化，整個頻域區間內3 h、2 h 的數值明顯高于1 h。其中1 kHz 以下，變化率均隨頻率增加而快速上升，100 kHz 以上，缺血2 h 和3 h的相對變化率隨頻率上升而下降；坐標（3 h，79.4 kHz）、（2 h，100 kHz）處阻抗相對變化率分別為48.7%和22.2 %，達到最大。

圖7 缺血不同時間的阻抗相對變化率隨頻率的變化曲線

缺血1 h 的腦部電阻抗變化相對較弱，因此僅選取缺血后3 h 和2 h 的結果與缺血前對比。3 h 的數據選取頻域區間內代表性的頻率點100 Hz、1 kHz、10 kHz、79.4 kHz、1 MHz，同理在2 h 時間點選取100 Hz、1 kHz、10 kHz、100 kHz、1 MHz 進行對比。圖8 的分析結果表明，在各個頻率點上缺血3 h 腦組織的電阻抗數值與缺血前正常組織的差異都有顯著性。綜上，缺血3 h，頻率為79.4 kHz 時，腦組織的阻抗相對變化率達到最大（48.7%），且與缺血前阻抗值的差異有顯著性。

圖8 缺血前與缺血后2 h（a）、3 h（b）的腦阻抗數據對比

我們一般認為缺血條件下的低頻阻抗變化更為顯著，但由于顱骨的屏蔽作用，低頻電流很難穿過顱骨。而本研究依據在體測量要求，通過顱骨外注入電流，觀察到最大阻抗變化率發生在70 kHz 左右，此頻率附近，顱骨電阻率相對低頻時已經有了較大幅度下降[17]，因而激勵電流能夠較好穿透顱骨，實現顱內缺血組織狀態的區分。綜上，3 h很可能成為EIT 技術診斷監測腦缺血損傷的非常關鍵的時間點，同時在上述時間及頻率附近，EIT 技術對缺血性腦卒中具有較高的敏感性。

3.3 缺血后腦組織超微結構改變及其與電阻抗特性變化相關性分析

理論上，缺血后腦組織電阻抗特性主要取決于兩個因素：血腦屏障變化和腦細胞體積變化。血腦屏障一般由微血管內皮細胞、周細胞、星形膠質細胞和基底膜構成，其中星形膠質細胞終足通過包繞約85%的腦微血管表面，形成腦微血管的多層膜性結構，有效防止循環中大分子物質和電解質進入腦實質，以維持神經系統內環境的穩定。血腦屏障被破壞后，電解質可自由通過血腦屏障，從而導致腦組織電阻抗的下降。而缺血后的腦細胞體積變化主要是腦細胞因缺氧導致的能量代謝障礙，使得細胞外離子內流、胞內滲透壓上升，進而引起細胞水腫。腦細胞水腫后，細胞體積增大且間隙變窄，從而會導致腦組織電阻抗的上升。

從缺血后的腦電阻抗變化情況可以看出：缺血后前3 h的阻抗整體呈上升變化。這很有可能是腦細胞缺氧、水腫變化導致的。在本研究的透射電鏡結果證實，腦缺血損傷3 h 時，右側大腦皮層的微血管壁周圍緊密包繞的星形膠質細胞終足發生明顯水腫，呈現空白區域，神經元和膠質細胞發生腫脹，但內皮細胞的間隙連接未見明顯破壞。電鏡結果表明血腦屏障結構中有細胞水腫的出現，但血腦屏障尚保持完整，阻抗上升變化與預期結果相符。

缺血3 h 以后腦電阻抗變化趨勢的改變很有可能與腦細胞的進一步水腫的同時，血腦屏障的完整性被破壞相關。Kwon 等[18]對腦缺血后微血管超微結構的研究證實，星形膠質細胞終足與微血管基底膜接觸的完整性于缺血再灌注4 h 后明顯下降，48 h 后完整性幾乎完全被破壞。如前所述，血腦屏障的完整性破壞后，腦阻抗有下降趨勢；與此同時，由于腦細胞的持續缺氧，細胞水腫程度進一步加劇，從而導致腦阻抗有上升的趨勢。可能正是這兩方面因素的共同作用，才使得缺血3 h 以后的腦阻抗呈現出階段性相對平緩的變化趨勢。

4 結論

本文研究了缺血性腦損傷后腦組織電阻抗隨頻率和時間的變化規律。結果表明，缺血性損傷后，不同時刻、不同頻率下的腦組織電阻抗變化特性均不同。其中，前3 h呈現快速上升趨勢，缺血3 h 時的腦電阻抗與缺血前存在顯著差異，且在79.4 kHz 時具有最大的相對變化率。提示我們：通過測量頻率的優選（3 h，79.4 kHz）有望進一步提高EIT 等阻抗測量技術對腦缺血性損傷檢測的靈敏度，而腦組織電阻抗隨時間變化特性也有望為腦缺血性損傷的程度評價提供支撐，從而為EIT 成像技術在超早期缺血性腦卒中的診斷和監測應用奠定基礎。