響應(yīng)面優(yōu)化馬比木喜樹堿提取工藝

周瑋 楊艷 張凡 高漸飛

摘要：在現(xiàn)已優(yōu)化出的馬比木喜樹堿提取工藝基礎(chǔ)上，采用同一產(chǎn)地樣品，分別以7個濃度梯度（40%～100%）的甲醇、乙醇為提取液，實驗篩選出提取率最高的提取液為70%的甲醇;進一步比較了目前馬比木喜樹堿提取的4幾種方法，提取效率值顯示浸泡超聲熱回流提取法最優(yōu)。在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對提取工藝進行了進一步優(yōu)化，獲得了最佳提取工藝為：浸泡時間14.80h.超聲時間30.70，液料比為60.00，70℃水浴中回流1.5h。在此工藝條件下，喜樹堿含量為2.29%，回歸得到的模型預(yù)測效果較好。將優(yōu)化工藝用于提取12個產(chǎn)地的馬比木喜樹堿含量，將其與文獻報道的相同區(qū)域樣品所測得最高含量比較，優(yōu)化出的工藝測得含量是其他工藝的2.4至10倍，大幅度提高了喜樹堿提取率。具有明顯優(yōu)越性。

關(guān)鍵詞：馬比木;喜樹堿;響應(yīng)面優(yōu)化;提取工藝

中圖分類號：R975 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）18-0163-05

1引言

茶茱萸科植物馬比木（Nothapodytes Pittosporoides）系海桐假柴龍樹，灌木或小喬木，分布于貴州、湖南、湖北、四川等地。馬比木全草人藥，是一種重要的藥用植物，人藥能祛風(fēng)除濕、理氣散寒，主治風(fēng)寒濕痹、浮腫、疝氣、小兒驚風(fēng)、半身不遂、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷以及浮腫等。馬比木植株含有喜樹堿，臨床上主要用于治療消化系統(tǒng)惡性腫瘤，為極具價值的抗腫瘤藥物資源。且馬比木根中喜樹堿的含量相對較高，一般都在0.1%～0.6%之間，高于喜樹果中喜樹堿的含量0.118%～O。190%。馬比木含有喜樹堿的發(fā)現(xiàn)，以及較低原料成本和較高的含量，使其成為提取喜樹堿的重要原料，一定程度上緩解了對喜樹資源的依賴。但馬比木對生長環(huán)境要求更為嚴(yán)格，生長緩慢，產(chǎn)量有限，且目前藥用部位為根，必須對樹木進行砍伐后采挖，極其不可持續(xù)。據(jù)報道中國湘西地區(qū)2008～2012年對外出售的馬比木根達1000t，無序的采挖導(dǎo)致該地區(qū)資源日欲瀕危;此時段貴州東北部（銅仁萬山區(qū)、松桃縣、印江縣等）馬比木種植資源也遭受毀滅性采挖，資源安全已受到嚴(yán)重威脅。目前，在無規(guī)模化栽植，以及沒弄清人工栽植條件下喜樹堿含量的狀況下，提高資源利用效率將是十分重要的途徑，這就需要落實到喜樹堿提取工藝優(yōu)化上來。

國內(nèi)對馬比木中喜樹堿提取分離和含量測定的研究已有報道。提取方法可總結(jié)如下：①浸泡，超聲提取;②浸泡，熱回流提取;③直接熱回流提取;④室溫浸泡提取提取;⑤堿法提取;⑥酸法提取;提取溶劑為甲醇、乙醇，還有酸、堿、樹脂等。鄭涓等以重慶黔江的馬比木根為樣品，甲醇為溶劑，采用浸泡，熱回流提取;通過單因素及正交試驗，確定最優(yōu)提取工藝為提取溶劑70%的甲醇，溫度為70℃，提取時間1.5h;根中喜樹堿的提取率0.16%。白永花等以湖南省鳳凰縣為樣品，同時采用乙醇（80%）熱回流提取法、乙醇（80%）室溫浸泡提取法、甲醇（95%）熱回流提取法、堿法提取、酸法提取，得出用80%乙醇溶液室溫浸泡提取3次，每次24 h，前12h每隔1小時超聲1次（功率260w，頻率40 kHz，每次5min）提取率最高，為0.944%。但上述結(jié)果，由于樣品產(chǎn)地及取樣時間不同[馬比木不同產(chǎn)地及季節(jié)喜樹堿含量不同，且用的提取方法和使用的提取溶劑、濃度不同，其結(jié)果間可比性差，難以判定究竟哪種提取工藝更有優(yōu)越性。此外，當(dāng)前提取工藝的研究中，浸泡、超聲等都有利于喜樹堿的細胞穿透、浸出，但沒有一個優(yōu)化的條件。為此，本文采用同一樣品，用7個濃度級（40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）的甲醇、乙醇作為提取溶劑、采取文獻報道過的提取方法（工藝條件）進行提取效率比較，確定最佳提取溶劑、濃度以及提取工藝。在此基礎(chǔ)上，進一步探究料液比、浸泡和超聲時間對提取喜樹堿的效果的影響，通過響應(yīng)面探尋馬比木中喜樹堿提取更有效的工藝和技術(shù)，為提升馬比木資源利用效率及獲得更大經(jīng)濟收益提供科技支撐。

2材料與方法

2.1儀器與材料

Agilent分析型高效液相色譜儀;BS210S型電子天平;XFB-500高速中藥粉碎機;DK-98-11型水浴鍋;喜樹堿（對照品），純度為98%以上;提取時所用甲醇、乙醇、分析純，HPLC所用甲醇、乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

馬比木測試樣品分別于2016年12月，2017年1月、2月、3采自貴州省松桃縣、萬山區(qū)、江口縣、播洲區(qū)、麻江縣，湖南省吉首市、古丈縣、鳳凰縣、永順縣、保靖縣，其GPS坐標(biāo)見表5。其中貴州省5個產(chǎn)地樣品由貴州省山地資源研究所采集鑒定;湖南省7個產(chǎn)地樣品由吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院呂江明教授采集鑒定。工藝優(yōu)化樣品來源12個樣品之一（樣品11，來源湖南省鳳凰縣吉信鎮(zhèn)萬溶江村）。

2.2提取方法

將采集來的馬比木根晾干，粉碎過60目篩，備用。在鄭涓等口優(yōu)化出的提取工藝基礎(chǔ)上，用不同濃度梯度的甲醇和乙醇進行喜樹堿的提取，確定最佳濃度的提取溶劑，然后采用以下4種方法，對馬比木根中喜樹堿進行提取。

2.2.1溶劑的選擇（浸泡超聲提取法）

將粉碎好的樣品統(tǒng)一稱取1g，按照料液比1：60加入不同濃度的甲醇和乙醇，濃度分別為90%、80%、70%、60%、50%、40%。室溫浸泡12h，超聲30min，補重，過濾，利用HPLC測定溶液中喜樹堿的峰面積。

2.2.2方法1（浸泡超聲提取法）

將粉碎好的樣品1g，加入2.2.1節(jié)優(yōu)化的溶劑及濃度，室溫浸泡12h，超聲30min，補重，過濾，利用HPLC測定溶液中喜樹堿的峰面積。

2.2.3方法2（熱回流提取法）

將粉碎好的樣品1g，加入2.2.1節(jié)優(yōu)化的溶劑及濃度，在70℃水浴中回流1.5h，補重，過濾，利用HPLC測定溶液中喜樹堿的峰面積。

2.2.4方法3（浸泡熱回流提取法）

將粉碎好的樣品1g，加入2.2.1節(jié)優(yōu)化的溶劑及濃度，室溫浸泡12h，在70℃水浴中回流1.5h，補重，過濾，利用HPLC測定溶液中喜樹堿的峰面積。

2.2.5方法4（浸泡超聲熱回流提取法）

將粉碎好的樣品1g，加入2.2.1節(jié)優(yōu)化的溶劑及濃度，室溫浸泡12h，超聲30min，在70℃水浴中回流1.5 h，補重，過濾，利用HPLC測定溶液中喜樹堿的峰面積。

2.2.6正交試驗

在已確定出的溶劑及提取方法基礎(chǔ)上，增加浸泡時間、超聲時間、液料比3個影響因子，按照正交試驗進行3因素5水平優(yōu)化實驗。

2.3對照品制備

取喜樹堿的對照品適量，精密稱定，加色譜甲醇制成濃度為0.6mg·mL^-1的對照品儲備液，避光保存，備用。利用HPLC測定喜樹堿對照品的峰面積，進樣量分別為：25、30、35、40、45、50uL。

2.4色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C 18（4.6mm×250 mm，5um）;流動相：甲醇一水（55l 45）;流速：1.0mL·min^-1;檢測波長：254nm：柱溫：26℃;進樣量：40uL。該色譜條件下喜樹堿對照品的色譜圖見圖1。

3結(jié)果與分析

3.1提取溶液及濃度

由表1結(jié)果可見，在相同的條件下，甲醇和乙醇提取喜樹堿面積存在差異性，甲醇提取率優(yōu)于乙醇。

不同甲醇和乙醇提取效率特征表現(xiàn)為：甲醇濃度為40%～70%時喜樹堿的峰面積隨著溶劑濃度的提高而增加，溶劑濃度達到70%時峰面積最高，隨后峰面積隨著溶劑濃度的增加而降低;乙醇濃度為30%～60%時喜樹堿的提取率逐步增加，之后乙醇濃度的增高的提取率降低?？梢?0%的甲醇更有利力喜樹堿在溶劑中的擴散，過高過低的溶劑濃度都不利于穿透細胞膜。

3.2不同提取方法提取效率

表2實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，各稱取1g粉碎好的樣品，分別在浸泡超聲提取法、熱回流提取法、浸泡熱回流提取法、浸泡超聲熱回流提取法4種提取方法下同等條件下檢測喜樹堿的HPLC峰面積。從表1可以看到，浸泡超聲熱回流法提取的喜樹堿含量最高。浸泡對有效成分的細胞穿透力有影響，超聲對有效物質(zhì)的擴散有影響，且熱回流能夠加速有機物質(zhì)的溶出速率，對其提取影響較大，幾個方面的優(yōu)勢使得方法4提取的有效物質(zhì)的峰面積最高。

3.3響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件

模型的建立與方差分析在上述2個實驗基礎(chǔ)上，增加浸泡時間、超聲時間、液料比3個影響因子，設(shè)計3因素5水平設(shè)計正交試驗（表2），根據(jù)Box-benhnken軟件設(shè)計正交實驗方案，其結(jié)果及方差分析見表3、表4。

對表3實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到以喜樹堿峰面積y關(guān)于各因素的回歸方程為：

y=0.001627+11938.93A+6383.70B-429.87C+1972.60AB+4977.75AC+1333.0OBC-31400.62A³-2381.8882-7558.53C³。

由表4方差分析可知，喜樹堿含量峰值面積回歸極顯著，且失擬項不顯著，說明此回歸模型是理想的，可以用用模擬提取時間（A）、料液比的（B）和超聲時間的（C）的變化的對喜樹堿峰值面積的影響。3個因素中提取時間（A）對峰值面積的影響均達到了顯著水平;影響力大小順次依次為提取的影響>料液比的影響>超聲時間。相互項A2對結(jié)果具有顯著影響，而其他影響不顯著。各因素對喜樹堿峰值面積的影響是一個復(fù)雜的過程，并非簡單的線性關(guān)系，存在交互作用。

由圖3可以看出，3個因素與峰值面積Y呈拋物線關(guān)系，即隨著各因素值的增加，峰值面積先增加后減少。

工藝條件的確定及驗證試驗為進一步確定馬比木喜樹堿提取工藝的最佳參數(shù)，采用根據(jù)Design-Expert8.0.6軟件在模型試驗水平范圍內(nèi)進行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為喜樹堿提取浸泡時間：14.76h，超聲時間：30.73，液料比為60.54，喜樹堿峰值面積7342.47。根據(jù)實際試驗條件，將工藝參數(shù)修正為喜樹堿提取浸泡時間：14.80h，超聲時間：30.70，液料比為60.00。在此工藝條件下，實測馬比木根中喜樹堿峰值面積為7299.00，與預(yù)測值的相對誤差為0.6%。

3.4不同產(chǎn)地馬比木根中喜樹堿含量

在上述修正工藝條件下，測試了貴州萬山區(qū)、松桃縣、湖南吉首市等12個產(chǎn)地馬比木根中喜樹堿含量。從表5可看出，12個產(chǎn)地馬比木喜樹堿含量在0.10%～3.89%之間，相互間差異較大;其中湖南省保靖縣夯沙鄉(xiāng)含量最高、貴州省麻江縣壩芒鄉(xiāng)最低。在優(yōu)化工藝條件下，除貴州麻江縣壩芒鄉(xiāng)外，其余產(chǎn)地含量都在1.50%以上;其中湖南省7個產(chǎn)地喜樹堿含量均≥2.29%，平均含量達到2.86%，遠高于貴州省5個產(chǎn)地平均含量（1.89%）。

與當(dāng)前文獻采用的工藝所得含量相互比較，本文優(yōu)化出的工藝測得鳳凰縣馬比木喜樹堿含量2.29%，遠高于白永花等（2014）優(yōu)化工藝下0.944%的含量，以及呂江明等0.53%的含量，古丈縣含量3.17%，也遠高于呂江明等（2010）0.49%的測得含量;永順縣含量2.84%，是呂江明等測得含量（0.31%）的9倍;吉首市三個產(chǎn)地樣品喜樹堿平均含量2.61%，也是其他工藝測得吉首馬比木最高喜樹堿含量（0.48%）的5倍;貴州銅仁市3個產(chǎn)地平均含量2.19%，亦是該地區(qū)其他工藝最高喜樹堿含量的12倍。

4結(jié)論與討論

在已優(yōu)化出的馬比木喜樹堿提取工藝基礎(chǔ)上，采用同一產(chǎn)地樣品，以甲醇、乙醇為提取液，通過實驗篩選出提取率最高的提取液及濃度為70%甲醇，并進一步比較了目前提取馬比木喜樹堿常見的幾種方法，確定最佳提取方法為浸泡超聲熱回流提取法。在此基礎(chǔ)上，通過Box-benhnken實驗設(shè)計建立浸泡時間、超聲時間、液料比與提取效率的回歸數(shù)字模型;通過分析可知3個因素對提取效率影響大小順序為：提取的影響>料液比的影響>超聲時間，且彼此間有較強的交互作用;最終確定最佳提取工藝為：提取浸泡時間：14.80h，超聲時間：30.70，液料比為60.00，70℃水浴中回流1.5h。在此工藝條件下，喜樹堿峰值面積為7299.00，與預(yù)測值的相對誤差為0.6%。

通過12個產(chǎn)地的馬比木喜樹堿含量測定及其與文獻報道的相同區(qū)域樣品所測得最高含量比較，本文優(yōu)化出的工藝測得含量是其他工藝的2.4～10倍，大幅度提高了喜樹堿提取率，具有明顯優(yōu)越性。利用此工藝條件提取馬比木中喜樹堿，可大幅度提升資源利用效率，以及產(chǎn)生更好的經(jīng)濟效益。

12個產(chǎn)地馬比木生長位置的經(jīng)緯度高底、海拔高度與含量關(guān)系并沒有呈現(xiàn)一致性特征，但喜樹堿含量最低的點海拔最高（樣品5），含量最高的點海拔最低（樣品12）。考慮到環(huán)境要素、測試樣品樹齡及長勢等綜合因素影響，是否低海拔地區(qū)栽植更有利于馬比木喜樹堿的產(chǎn)生，獲得更高的含量，有待進步一證實，旨為人工栽植環(huán)境選擇提供支撐。