血培養奧默柯達酵母鑒定方法學比較及藥物敏感性

周夢蘭，于淑穎，肖 盟，徐英春

近年來，侵襲性真菌病（IFD）的發病率不斷增高，逐漸成為導致住院患者高發病率和病死率的重要原因之一，給患者的預后和生命安全帶來很大的威脅[1-2]。真菌血癥已成為醫院感染性疾病的第四大病因，總體病死率高達 40%，而且大大增加醫療支出[3-5]。盡管白念珠菌（Candida albicans）依然是引起IFD的主要病原菌，但是近年來IFD中非白念株菌如近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、光滑念珠菌（Candida glabrata）、熱帶念珠菌（Candida tropicalis）及其他少見酵母如奧默柯達酵母（Kodamaea ohmeri）等的檢出率也在逐漸增高[6-7]。

本研究基于CHIF-NET監測數據，對2010－2016年7年間血培養分離的奧默柯達酵母的流行病學數據及藥物敏感性進行分析總結。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

選取我國多中心侵襲性真菌監測項目CHIFNET 2010－2016年連續7年收集的奧默柯達酵母，在中心實驗室進行復核鑒定及藥物敏感性檢測，對其流行病學數據進行分析。

1.2 方法

1.2.1 菌株復核鑒定 所有菌株均在沙保弱培養基上進行復蘇、傳代及分純。菌株鑒定以26S rDNA測序為金標準[8]，分別評估了法國生物梅里埃公司的VITEK 2-Compact、VITEK MS和德國布魯克公司Bruker MS的鑒定性能。對Bruker MS，本課題還同時進行了直接涂布法和甲酸-乙醇蛋白提取法兩種前處理方法結果的比較。質譜鑒定具體操作遵照儀器使用說明。VITEK MS判定標準：可信度為綠色方框（可信度60.0%～99.9%）的為鑒定至種水平，黃色三角的為低分辨率，紅色圓圈的為無鑒定結果。Bruker MS判定標準：鑒定分值≥2.0為鑒定至種水平，1.7≤鑒定分值＜2.0為鑒定至屬水平，鑒定分值＜1.7的為無準確鑒定結 果。

1.2.2 菌株原始鑒定 基于復核鑒定結果，對所有奧默柯達酵母的原始鑒定結果進行回顧性分析、總結。各參加單位所使用的原始鑒定方法主要包括VITEK 2-Compact、VITEK MS、ATB 32C、APC 20C以及CHROM agar顯色平皿。

1.2.3 抗真菌藥物敏感性檢測 參照CLSI 標準，采用標準微量肉湯稀釋法（BMD）檢測8 種常用抗真菌藥物：氟康唑（0.25～256 mg/ L）、伏立康唑（0.015～16 mg/L）、伊曲康唑（0.015～16 mg/ L）、泊.康 唑（0.015～16 mg/ L）、.泊.凈（0.008～8 mg/ L）、.卡.凈（0.008～8 mg/ L）、5-.胞.啶（0.064～64 mg/ L）、.性.素B（0.015～16 mg/ L）的最低抑菌濃度（MIC）值[9]。抗真菌藥物標準粉均購自中國食品藥品檢定研究 院。

2 結果

2.1 菌株分布

2010－2016年，CHIF-NET監測網共收集到34株來自全國12個省份16所醫院血培養陽性患者分離的非重復奧默柯達酵母。其中2016年分離19株，占所有菌株的55.9%。該菌感染患者中男20例，女14例，分別占58.8%和41.2%。患者分布科室中外科占47.1%（16/34），其次為內科23.5%（8/34）、重癥監護室14.7%（5/34）、兒科8.8%（3/34）、急診科2.9%（1/34）和器官移植科2.9%（1/34）。

2.2 26S rDNA復核鑒定及評估

34株奧默柯達酵母26S rDNA測序結果經與GenBank比對，與標準株CBS 6722相似度達99% ～100%。三種表型鑒定方法比較結果顯示：VITEK 2-Compact及VITEK MS分別可將94.1%（32/34）和100%（32/32）的菌株鑒定到種水平。Bruker MS直接涂布法及甲酸-乙醇提取法的種水平鑒定率分別為8.8%（3/34）、97.1%（33/34），屬水平鑒定率分別為67.6%（23/34）、2.9%（1/34）。見表1。

2.3 26S rDNA復核鑒定和原始鑒定比較

34株經26S rDNA復核鑒定為奧默柯達酵母與當地醫院的原始鑒定的結果比較見表2，原始鑒定結果中僅有58.8%（20/34）的菌株被當地醫院準確鑒定為奧默柯達酵母。其余14株奧默柯達酵母被VITEK 2-Compact、APC 20C、ATB和CHROM agar顯色平皿錯誤地鑒定為白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌等其他念珠菌種。

2.4 藥物敏感性

因目前CLSI/EUCAST均尚無奧默柯達酵母折點，故對BMD檢測8種抗真菌藥物的MIC50、MIC90及MIC范圍歸納于表3。由表可見，除氟康唑MIC90高達16 mg/L外，其余7種抗真菌藥物對奧默柯達酵母均呈現良好的體外抗菌活性，MIC90為0.25～1 mg/L。

表1 34株血培養陽性奧默柯達酵母VITEK 2-Compact、VITEK MS和Bruker Biotyper MS鑒定結果比較Table.Performance of VITEK 2-Compact，VITEK MS and Bruker Biotyper MS compared with ITS gene sequencing in identification of 34 Kodamaea ohmeri isolates from blood culture

3 討論

奧默柯達酵母，原名奧默畢赤酵母（Pichia ohmeri及Yamadazyma ohmeri），是一種產子囊孢子酵母，最初從腌制蔬菜或腐爛水果中分離到，因其發酵作用而廣泛應用于食品加工產業[10]。奧默柯達酵母歸屬于柯達菌屬，除奧默柯達菌種外還包含其他4個種（K.anthrophila、K.kakaduensis、K.laetipori和K.nitidulidarum），據現有報道僅奧默柯達酵母對人類有致病性[10]。但奧默柯達酵母并不是臨床常見的致病菌，該菌于1984年首次在胸水標本中分離到，在當時被認為是污染菌或是無害的定植菌。自從1998年首例報道奧默柯達酵母引起的菌血癥以來[11]，各種由奧默柯達酵母引起的IFD逐漸增多，包括膿毒癥或真菌血癥[12-13]、導管相關血流感染[14-15]、腹膜炎[16]、心內膜炎等[17-18]，病死率較高。另有研究報道奧默柯達酵母在兒科病房引起暴發性醫院感染[19]。

本研究首次對多中心陽性血培養分離的奧默柯達酵母進行菌種復核鑒定和抗真菌藥物敏感性數據分析總結。質譜作為新興的快速病原菌鑒定方法，在臨床微生物實驗室得到廣泛的使用。但由于奧默柯達酵母目前仍然分離較少，現有研究仍主要集中于個案報道，菌株鑒定大多使用基因測序的方法進行。目前僅有一篇文章報道顯示使用Burker MS甲酸-乙醇提取法對奧默柯達酵母進行準確鑒定[14]，因此本研究對多中心分離的奧默柯達酵母進行了不同表型鑒定方法的性能比較。相比較而言，VITEK 2-Compact及VITEK MS對奧默柯達酵母的鑒定效果較好；而Burker MS因樣品前處理方法的不同鑒定效果相差較大，甲酸-乙醇提取法的鑒定效果遠優于直接涂布法。回顧當地醫院的原始鑒定結果發現，34株奧默柯達酵母中僅有20株被正確鑒定，正確率為58.8%（20/34）。有6株奧默柯達酵母分別被CHROM agar顯色平皿鑒定為白念珠菌（n=3）、熱帶念珠菌（n=2）、光滑念珠菌（n=1），顯示鑒定結果完全錯誤。因奧默柯達酵母菌落顏色隨孵育時間的延長會出現特征性粉色到藍色菌落變化，菌落顏色的完全轉換可能需要1周時間[20]。而CHROM agar顯色平皿主要通過平皿顏色變化判斷結果，因此判讀過早或過晚均會導致判斷失誤，同時本研究在使用CHROM agar顯色平皿進行鑒定時可能需要持續進行2～5 d菌落顏色變化觀察。與印度單中心血流分離的奧默柯達酵母研究類似，除氟康唑外，本研究中分離的奧默柯達酵母對其他7種抗真菌藥物呈現良好的體外活性，提示其體內治療可能有效[21]。

表3 34株血培養陽性奧默柯達酵母體外抗真菌藥物敏感性Table.In vitro antifungal susceptibility of antifungal agents against 34 Kodamaea ohmeri isolates from blood culture

綜上，本研究顯示，在引起IFD的病原中，奧默柯達酵母相對罕見，但感染病例的增加提示我們必須對其引起重視，早期準確快速鑒定及抗真菌藥物敏感性檢測對其感染治療至關重要。