對屠宰場非洲豬瘟檢測的幾點思考

文│吳日鈞（江蘇省海安市曲塘鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站）

按照《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關于加強屠宰環(huán)節(jié)非洲豬瘟檢測工作的通知》（農(nóng)牧發(fā)[2019]7號）和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部119號公告要求，即使是年屠宰量5萬頭以下的屠宰場（企業(yè)）也不得遲于2019年7月1日前全部實現(xiàn)非洲豬瘟自檢；駐場官方獸醫(yī)必須要監(jiān)督生豬屠宰場（企業(yè)）按照 “批批檢，全覆蓋” 的原則全面開展非洲豬瘟檢測，不得遺漏任何一批次生豬的檢測。

屠宰環(huán)節(jié)是連接生豬產(chǎn)銷的關鍵環(huán)節(jié)，在屠宰環(huán)節(jié)實施非洲豬瘟自檢制度，而不是在生豬產(chǎn)地養(yǎng)殖場戶實施，能以最小人力、經(jīng)濟成本來取得最大控制、切斷病毒傳播途徑的效果；而在屠宰場，容易采集樣品，容易結合臨床和剖檢情況判斷，能夠及時發(fā)現(xiàn)并且開展追溯，及時消除隱患；還能夠嚴防染疫生豬產(chǎn)品進入食品加工流通環(huán)節(jié)，消除消費者對食用豬肉的擔憂，扶持養(yǎng)豬戶的積極性，保護生豬健康發(fā)展。

屠宰場（企業(yè)）開展非洲豬瘟自檢，對屠宰場（企業(yè)）實驗室環(huán)境、技術人員、儀器設備和檢測試劑都有著高標準要求。要建設符合標準的病毒核酸（熒光PCR）檢測實驗室，并配備非洲豬瘟熒光PCR檢測技術人員，按程序步驟規(guī)范操作處理。當前，學習提高非洲豬瘟的檢測技術成為屠宰場（企業(yè)）檢測、復核、監(jiān)督等人員的必修課。

為做好屠宰環(huán)節(jié)非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR）工作，參考《非洲豬瘟診斷技術》（GB/T 18648-2002），筆者有以下幾點思考：

一、確保樣品來源規(guī)范采集

在確保全覆蓋的前提下， 可以進行入場前檢測，即在生豬進場前，以車為單位，采集全部生豬血液樣品，均勻混合后進行檢測。每車生豬采集血液后檢測時抽取血液體積數(shù)量要一致；有的地方實行每份混合血液來源的生豬數(shù)量要控制在50頭以下，即生豬數(shù)量每50頭或者不足50頭時，做1份混合血液的非洲豬瘟檢測。具體混樣生豬數(shù)量可根據(jù)所使用的檢測試劑盒的技術指標科學確定。采集時，最好選擇瘦弱的生豬作為采集對象，以便更好發(fā)現(xiàn) “問題豬”，發(fā)現(xiàn)后盡早按規(guī)定處理。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)對生豬屠宰環(huán)節(jié)非洲豬瘟檢測有關要求進行了補充，即按照農(nóng)牧便函[2019]606號要求，生豬屠宰場（企業(yè)）要按照 “頭頭采、批批檢、全覆蓋” 的原則，對每一頭待宰生豬都要采集其血液樣品；若選擇在生豬進入屠宰場（企業(yè)）前進行采樣的，也必須對每一頭擬進廠（場）生豬進行采血，做到抽樣全覆蓋。若同批豬中有病死豬，應優(yōu)先采集病死豬的脾臟、淋巴結等組織病料開展實驗室檢測。將采好豬血的注射器或者采血管在室溫下傾斜靜置2～4小時（防止暴曬），或者置于37℃溫箱內1小時，待大部分血清析出后，取出血清，必要時離心分離血清（最低建議量為5毫升）。

樣品的采集、運輸與保存應當符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的《非洲豬瘟疫情應急實施方案（2019版）》的要求。

二、確保診斷試劑可靠和操作規(guī)范科學

嚴格非洲豬瘟病毒診斷試劑質量和檢測操作程序。要考慮試劑是否可靠穩(wěn)定，操作是否規(guī)范科學。

要使用經(jīng)過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準或者經(jīng)過中國動物疫病預防控制中心比對符合要求的檢測方法和檢測試劑盒。要強化檢測技術保障，細化檢測標準和查找程序。要按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部154號公告中的檢驗試行規(guī)程、質量標準等執(zhí)行。

陽性對照的Ct值＜30且出現(xiàn)特異性擴增曲線；陰性對照應無Ct值或者Ct值≥40且無特異性擴增曲線，線形為直線或者輕微斜線，無指數(shù)增長期。試驗結果才有效；否則應該重新進行試驗。

被檢樣品Ct值應＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為陽性；當無Ct值或者Ct值≥40，判為陰性。

PCR檢測的每一步都應在專門區(qū)域或者地點進行；使用前應該將熒光PCR預混液、陰性對照和陽性對照完全融化，充分振蕩混勻，瞬時離心，盡量吸取液體上層；試劑盒不同組分間不得交叉，樣品、陽性對照等在使用后及時封蓋，避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性；樣品、凍存試劑要避免反復凍融。

凡每一個步驟要吸取轉移樣品時均應該更換一個移液器吸頭（槍頭）。

在操作過程中對時間、試劑體積等精確控制可以獲得最佳的效果；特別用移液器吸取幾微升的液體時，吸取時要足量，轉移注入時要徹底注入，因為本來轉移的液體就是微量，不能有一點點出入。

檢測過程中應該使用不帶熒光物質的一次性乳膠手套。

三、保證檢測數(shù)據(jù)真實可靠

每次檢測時， 必須要設立陰性對照和陽性對照，不可為降低檢測成本而省略此步驟；對檢測中的陰性對照和陽性對照閾值數(shù)據(jù)，要定期比對、校對；確定檢測儀器、熒光PCR儀（包括配備的便攜式電腦）、器材等是否需要維護保養(yǎng)。要保證檢測結果的真實可靠、準確科學，必須如實記錄檢測結果。

四、檢測臺賬是否完整

要完整詳細原始保留檢測報告和臺賬，不得涂改，中間各項不得漏缺。

五、加強屠宰場實驗室內部管理

屠宰場（企業(yè)）的實驗室建設可以參考河南省非洲豬瘟疫情防控工作應急指揮部制定的《生豬養(yǎng)殖屠宰及加工環(huán)節(jié)非洲豬瘟病毒核酸檢測實驗室建設技術指南》中的標準要求，屠宰場（企業(yè)）實驗室分設掛、貼有明確標識的更衣室、樣品處理室、試劑配置區(qū)、核酸提取區(qū)、擴增分析區(qū)、無害化處理室，并配備適用的消防等應急器材。屠宰場實驗室制定并嚴格落實生物安全管理、安全防護、感染控制和生物安全應急預案等規(guī)章制度。

實驗室要進行消毒效果的評估，使其嚴格消毒程序，強化消毒工作，達到有效消毒目的。屠宰企業(yè)建設符合PCR檢測技術要求的實驗室，檢測試劑供應單位對屠宰企業(yè)檢測技術人員進行培訓，并跟蹤服務。要定期對實驗室的操作環(huán)境條件進行評估。

六、做好廢棄物無害化處理

要做好檢測后的樣品（血液）及實驗產(chǎn)生的廢棄物（如：一次性采血盛血器、一次性使用真空采血管、一次性PE手套、耗材、器械）的及時收集，并進行無害化處置和消毒滅菌處理工作；感染性廢棄物應該高壓滅菌之后再轉移至指定地點處理。嚴格做好清潔消毒工作。屠宰場（企業(yè)）和個人不得留存陽性樣品，不得將陽性樣品轉送或者轉賣給其他單位和個人。

七、完善相應檢測技術支持

非洲豬瘟熒光PCR檢測技術對操作人員的素質能力和對PCR原理的知識儲備是有要求的。否則，在操作和讀取數(shù)據(jù)時都容易出現(xiàn)紕漏。同時，熒光PCR檢測技術還存在如下的現(xiàn)實問題：檢測環(huán)節(jié)多，質量控制點多；操作相對復雜，反應時間較長；試劑組分多，需要自行配制；分區(qū)進行，環(huán)境控制要求嚴格等。檢測的結果有可能因為血液樣品保存不當或溶血、試劑回溫失誤等原因而受到影響。

因此，屠宰場（企業(yè)）做好非洲豬瘟檢測工作，不但要有符合標準的熒光PCR檢測實驗室和規(guī)章制度，還要有懂得PCR原理和操作的技術人員。同時，采樣、檢測、復核、監(jiān)督等人員要具備責任心和實事求是的態(tài)度，要有擔當精神；并要堅持日常清洗消毒制度。