超低溫冷凍技術應用于魚精子保存的研究進展

李景春 柯文杰 楊虹 于輝 楊映

摘要：介紹了超低溫的發展歷程、目前所取得的成果和優勢所在，回顧了我國漁業生產中魚精子的超低溫的應用，及未來市場的發展前景。分析了該技術在應用過程中影響結果的因素，稀釋劑、抗凍劑、凍融方法在操作過程中的原理原則和注意事項，以及目前解決超低溫過程中產生問題所能采取的方法措施，總結了超低溫目前存在的缺陷和未來需要發展的方向，有益于超低溫冷凍在漁業領域大面積的推廣及應用。

關鍵詞：超低溫冷凍;魚精子;玻璃化;稀釋液;抗凍劑;漁業

中圖分類號： S961.2+2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0066-04

收稿日期：2019-06-21

基金項目：國家轉基因生物新品種培育重大專項項目（編號：2018ZX08010-08B）;廣東省動物分子設計與精準育種重點實驗室[編號：（2019）75號]。

作者簡介：李景春（1989—），男，廣東湛江人，碩士研究生，主要從事魚精子超低溫冷凍方向的研究。E-mail：lijingchun1124@126.com。

通信作者：楊?映，博士，副教授，主要從事魚精子超低溫冷凍技術的研究。E-mail：4161341613@163.com。

隨著科技高速發展，低溫冷凍技術得到了大力發展，不再只是應用于食品，更是延伸到了生物學的各個研究方向，其中保種育種是一個方興未艾的方向。在實際生產過程中，豬、牛、山羊等哺乳動物精子應用低溫冷凍技術在養殖行業比較多，常見于各類新聞報道，而低溫冷藏則存在著比較突出的弊端，即無法進行長期保存。隨著魚類養殖業的迅速發展以及雜交育種、優良品種的選育與提純復壯等工作的開展，魚類精液保存技術的應用越來越廣泛。魚類精液的保存方法有常溫保存、冷藏保存和超低溫冷凍保存。常溫保存和冷藏保存用于短期保存精液，而超低溫冷凍則用于長期保存精液[1]。自20世紀50年代英國學者 Blaxter利用干冰（-79 ℃）成功保存太平洋鯡魚精巢，在復蘇后仍能獲得80%以上的受精率后[2]，魚精子的超低溫保存開始引起各國學者的關注。據統計，目前已有200多種魚類精液得到了成功保存的先例。常見的有鯉魚、四大家魚、鱈魚、虹鱒、鮭魚、大馬哈魚、歐洲鰻、小體鱘、短吻鱘及花狼魚等等[3]。大量研究表明，魚類精液的超低溫冷凍保存具有嚴格的種屬特異性，目前很難找到一種統一通用的方法[4]。

從目前發展來看，超低溫冷凍技術無論是在醫學還是農牧漁業等領域，已表現出了顯著的應用價值[5]，是未來漁業發展中人工授精的一個樞紐，主要體現以下幾個方面優勢：（1）大大節約資源成本。不再需要花費大量的物力、人力、財力來飼養大量的活體動物。（2）使用靈活便捷。不受時間空間限制，隨時隨地都能及時為科研或生產提供精子或胚胎，避免了雄雌性成熟不同步的顧慮，同時也解決了區域的遠近距離問題。（3）降低生產風險。超低溫冷凍技術能夠最大限度地減少外界環境因素對實驗動物種質資源的干擾，避免了動物源性疾病的傳播。（4）能夠進行長時間保存。避免考慮基因丟失、世代間隔、遺傳漂變等活體保種所存在的各種各樣問題。（5）通過冷凍配子能夠擴大雜交范圍，同時避免近交衰退。（6）建立重要物種資源庫。為建立魚類種質資源庫開辟了一條新的途徑[6]。本文則是在超低溫冷凍的基礎上對此技術進行分析和對未來進行展望，以期為魚類種質資源保護和魚類遺傳育種的研究提供參考。

1?超低溫冷凍技術概況

超低溫冷凍技術是指超低溫（-196 ℃）狀態下，生物細胞的代謝活動幾乎完全停止，生命活動處于靜止狀態，從而使其可以得到長期保存的一種技術[7]。超低溫冷凍過程中，當冷凍溫度繼續下降，冷凍速度達到一定程度時，水分子表現為玻璃樣的超微粒結晶核結實均勻的團塊[8]。這是液體轉變為非晶態（玻璃態）的固化過程，是一種可逆的轉變，玻璃化冷凍是一種無晶形固化的物理現象，其本質是液體在快速超低溫冷凍過程中，連續地固化形成無晶形、高度黏稠狀態的玻璃體，玻璃化的主要特點是高濃度冷凍保護劑和瞬間降溫（-130～-196 ℃，0～-60 ℃是冰晶形成的危險期），避免冰晶所造成的對細胞損傷和凍融效應。在超低溫冷凍保存下，可以有效地將細胞內酶、蛋白質及其他細胞結構完好地保存下來，經最佳條件解凍復蘇后，細胞仍然具有原來的代謝活性和功能性[9]。

2?超低溫冷凍在魚類精液保存中的應用

魚的精子由頭、頸、尾3個部分組成，頭部含有線粒體，并為精子提供營養;尾部又稱為鞭毛，是精子的運動器官。精子中主要含有鈉、鉀、鈣、鋅、鎂等金屬元素，其中鈉和鉀占總金屬元素的99.7%～ 99.8%，起著穩定滲透壓和抑制精子的作用[10]，整體來說，魚的精子偏堿性，pH值在7.3～8.5區間，密度和濃度受季節的影響[11]。精子在精巢中處于靜止狀態，一旦排入水中，精子便被激活。由于精子的原生質極少，能量極其有限，當精子排入水中被激活后，壽命很短，因而可以利用降低精子代謝率的方法減少能量的消耗，以達到延長精子壽命的目的[12]。在魚類的育種繁殖中，常常出現雌雄性成熟不同步現象，或者是雌雄魚不同區域等問題，因此解決此問題的最佳途徑是通過對精子的超低溫冷凍，以達到隨時隨地都可進行供用的目的。

目前，魚類精子的超低溫冷凍，是在魚的精子中按照一定比例加入稀釋劑和抗凍劑，以達到精子內外滲透壓的平衡，降低冰點，抑制精子的運動，使精子處于休眠狀態而結構又沒受到損傷，需要時解凍激活即可。常見的工藝流程為精液采集→鏡檢（活力>80%）→添加稀釋劑和抗凍劑→降溫平衡→液氮保存→解凍復蘇→活力檢測→授精。國外許多學者早在20世紀 70年代就對精子超低溫保存進行過較詳細的報道[13-14]。其中，整個流程，最為關鍵的是添加稀釋劑、添加抗凍劑、降溫平衡這3個步驟，可以說是直接導致冷凍成敗的主要因素。由于不同種類魚的精子生理特性具有很大差異性，目前沒有通用的稀釋劑和抗凍劑，每位學者在做試驗中都是根據相關文獻以及結合自己的經驗對稀釋劑和抗凍劑進行篩選的。冷凍方法常見的有以下4種：小丸顆粒冷凍法、安培瓶冷凍法、塑料離心管法、麥細管冷凍法。小丸顆粒冷凍法是將混合好的精液直接滴入液氮中保存，解凍時需要合適的解凍液;其他3種冷凍法的優勢是避免了精液與液氮直接接觸，但安培瓶由于體積較大，降溫難以平衡，且操作復雜[15]。塑料離心管冷凍法容量大，操作簡單，存放安全。麥細管冷凍法相對來說受溫較快而又均勻，效果好，操作也簡單。后面的這2種方法是目前主要使用的冷凍方法。無論是鮮精還是凍精，運動率都是評價精子質量的重要標準。按照精子運動活力狀態，大概可以分為4個等級。A級：快速前向運動;B級：慢速或呆滯前向運動;C級：非前向運動;D級：極慢或不動[4]。在試驗中，通常是選取活力大于80%精子進行超低溫保存[16]，活力分析分傳統的顯微鏡觀察和現在主流的依靠計算機輔助分析（CASA）等，由于精子被激活后運動速度快和壽命時間短暫，傳統的顯微鏡觀察分析視野難以準確判斷運動率。相對而言，計算機輔助分析就顯得比較客觀、精準、快速并且可以量化分析精子的生理特性，因此，根據目前所報道的文獻來看，幾乎是以后者為主[11]。在精子質量分析中，主要檢測AB這2個級別精子動態，參數有以下這些：（1）運動的直線性（LIN）;（2）平均曲線運動速度（VCL）;（3）平均直線運動速度（VSL）;（4）平均路徑運動速度（VAP）;（5）精子平均側擺幅值（ALH）;（6）精子平均鞭打頻率（BCF）;（7）精子平均移動角度（MAD）;（8）運動的擺動性（WOB）;（9）運動的前向性（SRT）;（10）檢測所用時間（T）等等。

3?影響魚精液超低溫冷凍的因素

由于超低溫冷凍步驟比較多，每個步驟在冷凍解凍操作過程中不同階段損傷的累積會影響后續試驗精子的死活。精液質量、稀釋液的選擇和比例的確定、pH值、滲透壓、抗凍劑的選擇和毒性、平衡條件、凍融方法以及授精條件等等都是水生動物精液低溫保存能否成功的因素。其中影響最大的分別是低溫保存劑和凍融方法，直接關系到試驗中精子冷凍后復溫能否存活。

3.1?稀釋液的影響

魚的精子排出體外后，由于環境變化、營養消耗，、能量代謝等原因，導致精子的存活時間縮短，從而死亡。因此，需要配制一種溶液來維持精子在體外的生理狀態，稀釋液一般沒有毒性，對精子也沒有激活效果。稀釋液是第一個與精子直接接觸的外來成分，是精子保存液的滲透壓、pH值、代謝調節、能量來源的主要“閥門”[17]。稀釋液的作用是使精子不受損害地以靜止狀態進入凍結狀態，以延長精子的壽命。另外，稀釋液還能稀釋加進來的抗冷劑的濃度，降低抗凍劑對精子的毒害強度[18]。由于不同魚類精子的特殊性，所以配制的稀釋液也不同，到目前為止，仍然沒有通用的稀釋液[19]。常見的稀釋液有鹽類（如碳酸氫鈉、氯化鈉、碳酸氫鉀、檸檬酸鈉等）、糖類（如葡萄糖、蔗糖、果糖等）、脂類（主要是磷脂）和蛋白質（如卵黃、牛奶、小牛血清等）以及其他添加劑（如維生素、抗生素等）[11]。海水魚用葡萄糖和檸檬酸鈉組成的稀釋液效果較好;淡水魚類稀釋液則以氯化鈉和氯化鉀為主，加入少量氯化鈣、氯化鎂、碳酸氫鈉和葡萄糖[20]。同時，不同濃度的稀釋液對精子有著很大的影響作用。顧正選等發現，使用0.5%濃度的NaCl溶液，齊口裂腹魚的精子運動活力最好[21];魏開金等發現，使用0.5%濃度NaCl稀釋液，鰣魚的精子快速運動時間和壽命達到最長[22];李飛等認為，0.6%濃度的NaCl對胭脂魚精子的運動時間和壽命都具有較佳的效果[23]。在稀釋液中，pH值的差異也最為關鍵，不同pH值對不同魚精子的壽命活力起到了不一的結果。大體上來說，魚的精子是中性或者偏堿性，酸性環境容易破壞精子細胞結構，使精子失活。楊彩根等發現，黃顙魚的精子在pH值7～9時活力最好[24]。孫翰昌等發現，禾花魚精子在pH值為7時活力最強[25]。朱冬發等認為，適宜大黃魚精子的pH值是7.5～8.0[26]。Na+、Ca2+、Mg2+ 、K+ 等離子既是魚類精子的重要組成部分，同時也是構成滲透壓的主要物質，對滲透壓維持起到了重要作用[27]。不同離子在不同魚類中所起的作用各有不同，K+在鮭科魚類中起著抑制精子活力的作用，但在鯉科魚類中卻能提高精子運動速度、延長精子活力時間[28]。所以在配制稀釋液時要根據對應的魚類選擇相對應的試劑，有利于提高精子冷凍的效果。在選擇和配制稀釋液時，盡量滿足以下條件：（1）溶液的等滲性和各成分互不反應;（2）能為精子提供適宜的環境和適宜的pH值;（3）不能含有對精子有害的物質和含有抗菌物質[17];（4）在保證精子生存環境的前提下，其成分組成越簡單越好[13]。

3.2?抗凍劑的影響

抗凍劑的選擇決定了精子在凍存中的生死存亡，抗凍劑通常是低分子中性物質，原理是通過結合水分子，發生了水合作用，黏性增加，降低形成冰晶的結冰點，從而阻止冰晶對于精子造成不可逆變的機械損傷，從而達到抗凍的目的。常見得抗凍劑有二甲基亞砜（DMSO）、甘油（Gly）、甲醇（MeOH）、丙二醇（PG）、乙二醇（EG）、單糖、二糖等等，其中，這又分為可滲透和不可滲透2種。DMSO、酰胺類、乙醇類屬于可滲透;單糖、二糖、多糖、聚合物等屬于不可滲透。不同動物的種質細胞對加入抗凍劑的適應性和敏感性也不同[29]。王小剛等將10%～25%甲醇（MeOH）用于點帶石斑魚精子冷凍保存沒有獲得復活率[18]。而夏良萍等用10%甲醇（MeOH）對黃顙魚精子冷凍保存有較好的保護效果[30];Chew等把乙二醇（EG）用于穗須原鯉精子超低溫凍存試驗時，發現效果不如甲醇（MeOH）好[31]。而程順等發現，乙二醇（EG）在翹嘴鲌精子超低溫凍存中取得最好的效果[32]。一般來說，抗凍劑對精子都存在著一定的毒性，當抗凍劑的濃度越大，毒性就越強，精子活力就越低[33]。這一觀點已得到眾多學者的認可。何斌等研究發現，甲醇（MeOH）、乙二醇（EG）、DMSO等抗凍劑隨著濃度的增加會導致魚精子的活力和運動時間相對應地下降[34]。閆秀明等研究發現，10%的DMSO對黃鱔精子的抗凍保護作用最好，毒性作用最弱[35]。王明華等認為，10%甲醇（MeOH）濃度對美洲鰣魚精子保存效果最好，超過15%濃度會導致精子死亡[36]。同時平衡時間的長短和溫度的高低與抗凍劑毒性也存在著一定的關聯。在配制抗凍劑的過程中，幾種抗凍劑的聯合使用，有利于降低毒性，提高精子的活力[37]。同時滲透性和非滲透性抗凍劑混用有利于保持細胞膜的完整性，選擇抗凍劑時優選選擇低毒性抗凍劑，同時使用過程中盡量縮短抗凍劑和精子的接觸時間，添加過程中可以考慮分步添加[38]，以免毒性過大直接導致精子死亡?？箖鰟毎亩拘灾饕l生在凍前和凍后處理的2個階段，抗凍劑加入時一步添加和分步添加都是根據不同魚種不同抗凍劑來選擇的;復蘇后將抗凍劑稀釋或者洗脫，稀釋和洗脫也有要求，如果添加或去除時操作不當，容易引起細胞損傷從而導致細胞死亡[11]?？偟膩碚f，選擇或者配制抗凍劑時，要根據以下幾個原則來執行：（1）抗凍劑對精子無毒或者盡量低毒;（2）抗凍劑對于精子不能有激活效果;（3）抗凍劑應具有營養性，增加精子的抗冷性能;（4）抗冷劑成分簡單易配。

3.3?其他因素的影響

除了稀釋劑和抗凍劑兩大主要因素對精子的成活率造成影響外，凍融方法的影響緊跟其后，0～60 ℃是造成細胞不可逆轉的機械損傷危險區[17]，適度降溫，細胞越過了危險區則可以投入液氮中直接長期保存。Stoss等在-20～-30 ℃溫度中保存銀大麻哈魚的受精卵復蘇后沒成活率，在-60～-100 ℃ 中保存泥鰍、草魚的胚胎，獲得10%～25%的胚胎復活率[14]。在冷凍過程中，降溫和復蘇都會造成細胞內水產生冰晶形成從而導致細胞損傷。因此，冷凍的步驟相對來說在整個超低溫冷凍鏈中有著非同小可的位置。一般而言，降溫分為3種形式：（1）慢速降溫;（2）2步降溫;（3）3步降溫[39]。眾多文獻資料顯示，2步降溫法和3步降溫法在試驗中比較常用。當降溫后精子能夠在液氮中長期保存后，復溫的過程就顯得極其重要，就算細胞以最佳的降溫方式保存于液氮中，也有可能在復溫過程中造成機械損傷而死亡。一般而言，降溫速度快的話，復溫的速度也需要相對應地加快，而在絕對值上，復溫速度還是要比冷卻速度快很多[40]，常用的復溫方式是水浴，35～40 ℃的溫水在1～2 min 內完成[41]。但也有學者通過室溫就能解凍成功。林丹軍等在室溫（21～25 ℃）解凍大黃魚精子取得不錯的效果[42]。當復溫成功后，抗凍劑的去除是一個不容忽視的問題，由于動物種質細胞沒有細胞壁，所以無法像植物一樣使用離心方法去除抗凍劑，相關學者都是通過添加溶液稀釋抗凍劑的毒性，若稀釋過程中溶液有著pH值、滲透壓的影響，會導致解凍后細胞的死亡?？箖鰟┤コ?，激活液的選擇也至關重要。由于魚精子添加了抗凍劑和稀釋劑，鮮精直接用水激活的方法已不適用解凍后的精子激活。陳松林等研究表明，由于DMSO的作用，冷凍過程中精子的滲透壓會升高，若直接水激活，則導致內外滲透壓過大，精子吸水后膨脹，活力大大下降[43]，所以一般選擇配制溶液為激活液。

4?結論

目前來說，魚精子的超低溫保存已取得了很大的進步，可以應用于漁業生產，解決生產上一定范圍內的難題。但是在相關文獻報道中，幾乎很少有學者報道精卵受精量比，如果用超過鮮精數量的凍精，10倍或數10倍的數量與一定數量的卵子配對，就算凍精活力很低，也能獲得比較高的受精率。通過提高數量來掩蓋凍存精子上存在的缺陷，相對來說是超低溫冷凍上存在的不足，阻礙了技術的發展。另外許多魚類的精子超低溫凍存只是存在于試驗摸索階段，影響試驗成果的因素很多，導致試驗重復性差。大量的研究結果表明，經過凍存后的精子多少都受到了深淺不一的低溫損傷（冰晶損傷、溶質損傷等），活力和受精率相對鮮精來說，還是略遜一籌。這是由于精子在溫度下降的過程中耐不了低溫而導致結構以及功能性破壞，另一方面是加入的抗凍劑的毒性影響了精子內外滲透壓的平衡從而導致了精子的凍傷，每種抗凍劑的毒理藥理導致精子死亡的機制至今沒有多少學者進行深入探索和發現。同時，對于精子在超低溫冷凍過程中造成的損傷本質所了解得還是不夠深入透徹，還有待進一步研究探索。關于冷凍前是否需要平衡，不同學者觀點不一樣，有的學者認為，DMSO等抗凍劑滲透性比較強，能容易地滲透到精子內部，凍前不平衡比平衡效果好[44]，但丁淑燕等在試驗過程中發現，平衡比不平衡效果好[45]。對于超低溫冷凍后復溫是否需要洗脫抗凍劑，目前也是沒有統一的標準。復蘇時水浴的溫度和時間分別是多少最為合適，也是沒有一個標準界限。魚精子凍存解凍過程中受損必然導致受精能力衰退，如何發揮超低溫凍存的優勢，又縮小凍精和鮮精之間的差距，是學者們的共同研究方向[46]。就目前情況而言，精子的超低溫冷凍在未來的發展中還是任重道遠，有待進一步深入研究和探索。

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