天然有機物添加對金釵石斛快繁的影響

李曉君 潘繼軍 曹琦 普婭

摘要：為研究蘭科植物組織培養常用有機添加物香蕉和馬鈴薯對金釵石斛快繁的影響，以云南臨滄野生金釵石斛蒴果為材料，比較金釵石斛在添加不同類型或不同濃度添加物的種胚萌發培養基、原球莖分化培養基、幼苗擴繁培養基、生根培養基上的生長情況，結果表明，在MS培養基基礎上添加馬鈴薯汁和香蕉汁均可促進金釵石斛種胚萌發和原球莖形成，最佳萌發培養基為MS+馬鈴薯汁30 mL/L+3%蔗糖;MS+馬鈴薯汁40～60 mL/L+3%蔗糖適于金釵石斛原球莖分化成苗培養，在MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁60～80 mL/L+3%蔗糖條件下幼苗的擴繁系數為4.8～5.1;MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁60～100 mL/L+3%蔗糖可用于金釵石斛生根培養。在金釵石斛組培快繁過程中，添加馬鈴薯汁可促進金釵石斛的種胚萌發、幼苗分化和擴繁，添加一定濃度的香蕉汁對金釵石斛生根具有較好的促進作用。

關鍵詞：金釵石斛;香蕉汁;馬鈴薯汁;培養基

中圖分類號： S567.23+9.043文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0079-04

收稿日期：2018-05-29

基金項目：滇西科技師范學院高層次人才科研啟動項目（編號：LXJ2012）;云南省科技廳青年項目（編號：2017FD249）。

作者簡介：李曉君（1985—），女，云南臨滄人，博士，副教授，研究方向為植物生物技術與種質創新，E-mail：lxj-148@163.com。

金釵石斛（Dendrobium nobile）別稱石斛，是主要的藥用石斛之一[1]。金釵石斛的化學成分主要包括生物堿、倍半萜、聯芐、芴酮、酚酸、苯丙素、菲、多糖等，具有抗腫瘤、降血糖、抗衰老、增強免疫力、促進胃液分泌、保護神經系統等作用[2-4]。金釵石斛花朵優美，具有較高的觀賞價值。金釵石斛可采用扦插、分株、壓條等方法進行繁殖，但由于生產效率較低，生產上金釵石斛的繁殖以組織培養（組培）為主，外植體材料可選擇莖段，也可用蒴果，蒴果因消毒容易，幼苗生成量大，在生產上經常被采用[1，5-6]。研究表明，向培養基中添加天然有機物可促進組培石斛苗的生長，其中添加馬鈴薯汁和香蕉汁對金釵石斛的快繁具有促進作用，但各研究報道的添加方法和添加量不一[6-11]。本研究以MS為基本培養基，在金釵石斛組織培養的不同生長階段添加不同濃度的香蕉汁或馬鈴薯汁，揭示香蕉汁或馬鈴薯汁添加濃度對金釵石斛各階段組培苗生長的影響，找出合適的濃度添加范圍，以期為金釵石斛種苗生產提供參考。

1?材料與方法

1.1?試驗材料及消毒方法

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）種植于滇西科技師范學院大棚[12]，于2016年4月對開花植株進行人工異花授粉，2016年11月收集蒴果進行培養。消毒方法：在超凈工作臺內，將金釵石斛蒴果用75%乙醇進行表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min，無菌水沖洗4次，將消毒后的果實置于滅菌的培養皿中，用解剖刀沿中心線縱切，用鑷子夾住其中1/2，小心將種子均勻播撒于胚萌發培養基中。

1.2?相關試劑

香蕉汁：取黃熟香蕉，切成0.5 cm左右小丁，按照香蕉 ∶蒸餾水為1 g ∶1.5 mL的比例加蒸餾水煮沸后，小火煮至香蕉軟爛，用紗布將上清濾出，用蒸餾水定容至濃度為1 g/mL，備用。馬鈴薯汁：取未長芽的馬鈴薯，切成細絲，按照馬鈴薯 ∶蒸餾水為1 g ∶1.5 mL的比例加蒸餾水煮沸后，小火煮至馬鈴薯軟爛，用紗布將上清濾出，用蒸餾水定容至濃度為1 g/mL，備用。試劑：MS基本培養基相關藥品為國產分析純，6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）[13]和萘乙酸（NAA）由Sigma-Aldrich 公司提供。

1.3?金釵石斛各階段培養基及培養條件

1.3.1?種胚萌發培養基

1-a：MS;1-b：MS+香蕉汁10 mL/L;1-c：MS+香蕉汁20 mL/L;1-d：MS+香蕉汁30 mL/L;1-e：MS+馬鈴薯汁10 mL/L;1-f：MS+馬鈴薯汁20 mL/L;1-g：MS+馬鈴薯汁30 mL/L。

該培養基添加蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.7%，pH值調整至5.8，每個培養基接種5瓶以上，接種后置于光照培養箱中進行培養，周期性培養條件：光照培養溫度為26 ℃，光照度為1 000 lx，培養時間為14 h;暗培養溫度為24 ℃，培養時間為10 h，培養2個月后進行萌發情況以及原球莖質量比較分析。

1.3.2?原球莖分化培養基

2-a：MS;2-b：MS+馬鈴薯汁20 mL/L;2-c：MS+馬鈴薯汁40 mL/L;2-d：MS+馬鈴薯汁60 mL/L。

該培養基添加蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.7%，pH值調整至5.8，選擇萌發情況最佳的原球莖，轉入該培養基中，每種培養基接種5瓶以上，接種后于置于光照培養箱中進行培養，周期性培養條件：光培養溫度為26 ℃，光照度2 000 lx，培養時間為14 h;暗培養溫度為24 ℃，培養時間為10 h。培養2個月后進行幼苗生長情況比較。

1.3.3?幼苗擴繁培養基

3-a：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L;3-b：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁20 mL/L;3-c：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁40 mL/L;3-d：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁60 mL/L;3-e：MS+6-BA 1 mg/L+NAA0.2 mg/L+ 馬鈴薯汁80 mL/L;3-f：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁100 mL/L。

該培養基添加蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.7%，pH調整至為5.8，每種培養基接種5瓶以上，接種時標記每瓶接種苗數。培養條件同種胚萌發培養基，培養2個月后進行擴繁系數比較。擴繁系數統計：每個處理隨機選取3瓶進行株數統計，擴繁系數=擴繁后瓶苗數/接種時苗數;株高測量：每個處理隨機選3瓶，每瓶選取5株測量株高。

1.3.4?生根培養基

選取擴繁系數高、質量好的瓶苗作為培養材料，接入以下生根培養基中，每種培養基接種不少于5瓶，4-a：MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L;4-b：MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁40 mL/L;4-c：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁60 mL/L;4-d：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁80 mL/L;4-e：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁100 mL/L;4-f：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁120 mL/L。

該培養基添加蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為7%，pH值調整至為5.8，培養條件：光培養溫度為26 ℃，光照度為2 000 lx，培養時間為14 h;暗培養溫度為24 ℃，培養時間為10 h。培養2個月后進行幼苗及根系生長情況比較。根量計數：每個處理選3瓶，每瓶隨機測3叢苗根量;根長測量：每個處理選3瓶，每瓶隨機測10根根長;株高測量：每個處理隨機選3瓶，每瓶選取5株測量株高;叢苗數統計：每個處理隨機選3瓶，每瓶隨機選5叢苗計數。

1.4?統計分析

試驗數據采用SPSS進行處理分析，采用LSD法進行差異顯著性分析。

2?結果與分析

2.1?香蕉或馬鈴薯汁及濃度對金釵石斛種胚萌發的影響

金釵石斛種胚播于種胚萌發培養基中培養2個月后，萌發情況見圖1，萌發率及原球莖形態統計結果見表1。除了對照1-a外，種胚在各培養基的萌發率均達到20%以上，隨著有機添加物濃度的升高，萌發效果變好，在添加馬鈴薯汁的培養基中萌發率均較添加同等濃度香蕉汁高，原球莖較為飽滿，緊密，在添加香蕉汁的培養基中，原球莖頂部幼葉較為開展，原球莖間疏松易于分離，添加馬鈴薯汁的培養基中原球莖幼葉較為緊湊。結果說明，添加香蕉和馬鈴薯汁均對金釵石斛種胚萌發具有促進作用，在添加香蕉汁的培養基中，底部的種胚愈傷化成黃色，無法形成正常原球莖，可見添加馬鈴薯汁較有利于種胚萌發和早期原球莖的生長。生產上金釵石斛胚萌發培養基推薦使用MS+馬鈴薯汁30 mL/L+3%蔗糖。

2.2?馬鈴薯汁添加量對金釵石斛原球莖分化的影響

選取1-g處理的金釵石斛原球莖轉入原球莖分化培養基中進行培養，培養2個月后，進行幼苗分化情況比較，結果見圖2，在未添加馬鈴薯汁的MS培養基中，金釵石斛幼苗較黃，基部愈傷化明顯，大部分原球莖分化不完全，未形成完整幼苗;在添加馬鈴薯汁的3個處理中，小苗分化較完整，基部無愈傷組織，原球莖分化率相近，小苗濃綠，相比2-b處理，2-c處理、2-d 處理的幼苗基部幼莖較粗壯，說明添加馬鈴薯汁對金釵石斛原球莖分化成幼苗具有促進作用，MS+馬鈴薯汁40～60 mL/L+3%蔗糖配方可用于金釵石斛原球莖分化成苗培養。

2.3?馬鈴薯汁添加量對金釵石斛擴繁的影響

選取處理2-d中的金釵石斛幼苗為材料，轉入擴繁培養基中進行擴繁，培養2個月后，進行擴繁系數和幼苗生長情況統計，結果見表2，可以看出，添加馬鈴薯汁對金釵石斛增殖和生長均有促進作用，其中對擴繁系數的影響達到顯著差異水平，馬鈴薯添加量達100 mL/L時，擴繁系數開始下降，添加量達80 mL/L時，苗高開始下降。在MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁60～80 mL/L培養基中，擴繁系數達5.0左右，苗高為3.5 cm左右，可作為生產用幼苗擴繁培養基。

2.4?香蕉汁添加量對金釵石斛生根培養的影響

選取處理3-d中的幼苗進行生根培養，接種2個月后進行生根量、根長、株高和叢苗數統計，結果（表3）表明，在添加香蕉汁的各處理中金釵石斛的生根量、根長和叢苗數都與未添加香蕉汁的4-a處理呈顯著差異，從整體趨勢來看，在40～100 mL/L范圍內，香蕉汁添加量與根量、根長呈正相關關系，當香蕉汁添加量達120 mL/L時，金釵石斛株高顯著下降，香蕉提取物可溶性糖類豐富，株高下降可能與培養基滲透壓過高有關。MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁60～100 mL/L培養基可用于金釵石斛生根培養，組培苗質量符合1級苗標準[5]。

圖3為本研究所選用的材料及各階段在最佳培養基中培養下的金釵石斛幼苗。

3?結論與討論

蔣波等發現，在以莖段為材料誘導金釵石斛擴繁過程中，添加10%的椰子汁有利于金釵石斛原球莖增殖，而10%的香蕉汁則有利于原球莖分化[6]。唐德英等認為，在萌芽、增殖和成苗階段均應選擇馬鈴薯汁為添加物，濃度為200 g/L，在生根階段應選用香蕉為添加物，添加量為150 g/L[7]。鄭建鈴研究發現，金釵石斛在分別添加70 g/L馬鈴薯泥和香蕉泥的1/2 MS培養基中萌發效果較好，其中添加70 g/L馬鈴薯泥的1/2 MS培養基對原球莖成苗效果較好，添加70 g/L香蕉泥的1/2 MS培養基對幼苗的生根效果較佳[8]。羅林會等在金釵石斛快繁體系的原球莖誘導增殖和分化階段均添加2%的馬鈴薯汁，生根階段添加2%濃度的馬鈴薯漿和香蕉汁，可以取得較好的效果[9]。徐德林等研究發現， 在金釵石斛種子萌發培養基中，添加10 g/L的馬鈴薯有利于種子萌發[10]。陳庭等在增殖培養基中添加20 g/L香蕉汁，取得了756.74%的類原球莖增殖質量率[11]。也有部分金釵石斛組織培養研究未添加任何天然有機物，而側重于激素配比研究。如楊瀾等在金釵石斛叢生芽誘導和增殖研究中，均未添加天然有機物[14-16]。目前尚未有專門針對金釵石斛組織培養中有機物及其添加量的研究報道，馬鈴薯和香蕉均為易于獲取的天然有機添加物，其價格低廉，適用于生產。大部分研究添加馬鈴薯和香蕉時未過濾，直接做成泥進行添加，本研究發現，馬鈴薯泥和香蕉泥不溶部分在制備培養基時容易沉淀于培養基底部，在分裝時常常造成不溶性物質分裝不勻，進而造成試驗誤差，因此在試驗方法中特別提出對二者的提取物進行過濾。本研究結合已有研究結果，在常規石斛及蘭科組織培養激素配比基礎上[17-18]，進行了馬鈴薯汁和香蕉汁添加和添加量的探討，從種胚到生根培養，獲得了較佳的有機物添加方案，可為后續金釵石斛大規模生產中的有機物添加提供參考。

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