基于ISSR標(biāo)記的藤本月季品種遺傳多樣性及其分子身份證的構(gòu)建

高鵬華 于文劍 趙芮 熊陽陽 王錦

摘要：38個藤本月季品種ISSR分子標(biāo)記結(jié)果表明，23條引物共擴(kuò)增出212個多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性比率高達(dá)72.35%。基因分化系數(shù)GS值變化范圍在0.755～0.971，變化幅度較小，品種親緣關(guān)系較近。38個藤本月季品種的群體遺傳參數(shù)中平均觀測等位基因數(shù)為1.973 5，平均有效等位基因數(shù)1.578 1，平均Neis基因多樣性指數(shù)為0.372 6，平均Shannons信息指數(shù)為0.572 3。38個品種間的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.785 6，基因流（Nm）為0.058 4，表明38個品種遺傳多樣性豐富。由聚類分析圖可知，38個品種可聚為3個大類7個分支。以23條引物中多態(tài)性較好且能區(qū)分這38個供試品種的17條引物對不同品種擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，建立了38個藤本月季品種的分子身份證。

關(guān)鍵詞：藤本月季;ISSR標(biāo)記;親緣關(guān)系;遺傳多樣性;分子身份證

中圖分類號： Q311;S685.120.36文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0098-04

收稿日期：2018-05-08

基金項(xiàng)目：國家林業(yè)局“948”項(xiàng)目（編號：2014-4-19）;云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目。

作者簡介：高鵬華（1993—），女，河南濮陽人，碩士，研究方向?yàn)閳@林植物與觀賞園藝。E-mail：786987934@qq.com。

通信作者：王?錦，博士，教授，研究方向?yàn)閳@林植物與觀賞園藝。E-mail：908505685@qq.com。

藤本月季（climber，CL）是現(xiàn)代月季的一個重要支系，枝長，蔓性生長，花大，1季或4季開花[1]。因其攀援和觀賞特性，藤本月季在觀賞園藝中占有重要的地位。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是一種簡單、快速、高效的研究植物遺傳多樣性與親緣關(guān)系的分子標(biāo)記方法，已廣泛應(yīng)用于狗牙根、紅麻、油茶、大菊等植物的遺傳多樣性與分類鑒定研究。周俐宏等利用篩選出的11條ISSR引物對3種月季類型的23份月季材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，表明月季種質(zhì)的遺傳差異與其應(yīng)用分類的相關(guān)性不緊密[2]。楊帆等利用ISSR分子標(biāo)記結(jié)合形態(tài)學(xué)指標(biāo)對17份薔薇屬植物進(jìn)行親緣關(guān)系研究，結(jié)果表明形態(tài)學(xué)聚類與ISSR聚類結(jié)果基本一致[3]。季春娟利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對17種薔薇屬植物進(jìn)行遺傳關(guān)系研究，表明17份供試材料遺傳多樣性較高[4]。劉燕運(yùn)用ISSR和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對13個觀賞桃品種進(jìn)行遺傳多樣性鑒定，結(jié)果表明與依據(jù)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果較一致[5]。劉君等對9份狗牙根進(jìn)行鑒定分析并建立了指紋圖譜[6]。劉振等以ISSR、SSR、RAPD 3種分子標(biāo)記方法對茶樹進(jìn)行分析，結(jié)果表明ISSR分子標(biāo)記多態(tài)性較高[7]。鄭海燕等以紅麻為材料，運(yùn)用ISSR和RAPD分子標(biāo)記方法對其分子身份證進(jìn)行構(gòu)建[8]。因此，運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對藤本月季遺傳多樣性親緣關(guān)系研究是可行的。

藤本月季品種資源豐富，品種間親緣關(guān)系復(fù)雜，為品種的保護(hù)和利用帶來一定的困難。我國自20世紀(jì)末引進(jìn)藤本月季以來，對于藤本月季引種、快繁技術(shù)、生長特性及抗逆性的研究不斷深入，但對其分子層面的研究尚處于空白狀態(tài)。因此，本研究以38個藤本月季品種為材料，運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對其親緣關(guān)系進(jìn)行聚類分析，以期為藤本月季雜交育種和品種保護(hù)提供一定的理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的38個藤本月季材料來源于西南林業(yè)大學(xué)藤本月季資源圃及校園內(nèi)綠化藤本月季品種，具體為Celme Forestier、The Wedgwood Rose、Handel、Abraham Darby、Glorie de Dijon、Souvenir du Doctor、Alchymist、Aloha、Eden Rose、Super Excelsa、Lady Hillingdon、Sir Paul Smith、Uetersen、Red Eden Rose、Bienvenue、Alfred Colomb、Phyllis Bide、Purple Skyliner、Giardina、Paul Transon、Pippin、Spirit of Freedom、Coral Dawn、Salammbo、Ginger Syllabub、Soleil Vertical、Granham Thomas、Papi Delbard、Clarence House、Moyesii Geranium、Cinderella、Blue Rambler、Parade、Hagoromo、Angela、Rosa multiflora f. carnea、R.multiflora var. platyphylla、R. multiflora var. cathayensis。

根據(jù)不列顛哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列合成ISSR引物，通過篩選，最終確定23條ISSR引物用于供試樣品擴(kuò)增。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?DNA的提取?本試驗(yàn)采用Omega試劑盒對藤本月季總DNA進(jìn)行提取，貯存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?PCR擴(kuò)增?引物由上海生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。23條引物為UBC 813、814、815、818、825、827、828、829、830、831、834、840、841、843、844、845、846、858、859、862、866、880、884。

PCR反應(yīng)為20 μL體系：10×PCR Buffer 2 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，dNTP 1.5 μL，Taq酶1.5 μL，ddH2O 12 μL補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，Tm值30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃10 min。

1.5%瓊脂糖凝膠檢測，利用Quantity One軟件分析電泳凝膠圖，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，進(jìn)行聚類分析，運(yùn)用Popgene軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?ISSR條帶和多態(tài)性分析

23條ISSR引物對共擴(kuò)增出293條帶，其中多態(tài)性條帶為212條，多態(tài)性比率為72.35%，每條引物擴(kuò)增出5～11條多態(tài)性譜帶，平均每條引物擴(kuò)增出12.74條多態(tài)性條帶。23條引物擴(kuò)增出的條帶在500～2 000 bp之間，不同引物在同一植物材料上擴(kuò)增的條帶數(shù)量和擴(kuò)增片段大小不同，表明不同引物與模板DNA的結(jié)合位點(diǎn)不同，同一引物在不同品種間的擴(kuò)增條帶也不同，如在用引物UBC 866對這38個品種進(jìn)行擴(kuò)增時，Blue Rambler存在條帶的特異性缺失，Angela的特異性擴(kuò)增等（圖1）。23條ISSR引物的平均多態(tài)性比率為73.7%，多態(tài)性比率位于56%～92%。這些都反映了藤本月季品種間的多態(tài)性差異。對比23條ISSR引物，其中20條為二核苷酸重復(fù)序列，2條三核苷酸重復(fù)序列，1條為五核苷酸重復(fù)序列，表明38份供試材料中二核苷酸重復(fù)序列多。

2.2?ISSR聚類分析與遺傳多樣性分析

利用Popgene 1.32軟件計(jì)算出38個不同品種之間的Neis基因多樣性指數(shù)（H）以及Shannons信息指數(shù)（I）。結(jié)果表明，38個藤本月季品種的平均Neis基因多樣性指數(shù)為0270 5，平均Shannons信息指數(shù)為0.406 9。38個品種間的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.785 6，基因流（Nm）為0.136 4。遺傳分化系數(shù)可以說明總遺傳變異78.56%來自品種間。由此可知，38個藤本月季品種間的遺傳分化水平較高，而基因交流頻率較低。

由圖2可知，38個供試材料共可分為3個大類7個較大分支。Salammbo與Angela、Bienvenue、Soleil Vertical、Souvenir du Doctor、Sir Paul Smith、Alfred Colomb、Abraham Darby、Clarence House、Ginger Syllabub、Eden Rose、Red Eden Rose 12個品種聚為一類，其中Red Eden Rose與其他品種的遺傳距離最遠(yuǎn)單獨(dú)成為一支，Soleil Vertical、Alfred Colomb、Abraham Darby、Bienvenue 4個品種的親緣關(guān)系較其他品種近聚為一小支;Parade、Glorie de Dijon、Lady Hillingdon、Uetersen、R. multiflora f. carnea、Spirit of Freedom同Coral Dawn 7個品種被分為一大支，根據(jù)相對遺傳距離遠(yuǎn)近，Glorie de Dijon被分在最外面一支，Parade與Lady Hillingdon、R.multiflora f.carnea均被單獨(dú)分出，剩下2個品種成為一小支;剩余19個品種被聚為一類，在這19個品種中Hagoromo與其他18個品種相對距離較遠(yuǎn)單獨(dú)成為一支，Granham Thomas與Celme Forestier聚在一起成為一支，Moyesii Geranium、Paul Transon、Papi Delbard、Giardina、Aloha、Cinderella與Pippin 7個品種被聚為較一大支，Pippin與Papi Delbard被聚在一起，Handel與R. multiflora var. platyphylla相對遺傳距離較近被聚在一起，Purple Skyliner與R. multiflora var. cathayensis單獨(dú)聚在一起。

2.3?分子身份證的建立

以23條引物中多態(tài)性好，且能區(qū)分38個藤本月季的17條引物建立分子身份證，其中有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。

3?討論與結(jié)論

自PCR技術(shù)發(fā)明以來，運(yùn)用PCR技術(shù)對動植物的遺傳多樣性進(jìn)行分析已經(jīng)成為最主要的一門技術(shù)。運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對植物的遺傳多樣性進(jìn)行分析對樣本的DNA濃度要求不高，而且操作簡單，價格低廉，試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性高，結(jié)果穩(wěn)定。趙凱歌在對臘梅屬種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR鑒定時發(fā)現(xiàn)，ISSR重復(fù)性高達(dá)99.08%[9]。本試驗(yàn)同樣獲得了較高的重復(fù)性。在運(yùn)用分子標(biāo)記對植物的親緣關(guān)系進(jìn)行分析方面，前人的研究都取得了一定的成果。本試驗(yàn)以38個藤本月季品種為材料，研究表明38份材料根據(jù)ISSR分子標(biāo)記多態(tài)性分類結(jié)果與其形態(tài)學(xué)觀賞特性分類存在一定的差異，如在遺傳相似系數(shù)為0.947時，可將Soleil Vertical與Souvenir du Doctor，Sir Paul Smith與Alfred Colomb分別分為2組，但Soleil Vertical的花為深黃色，半重瓣，Souvenir du Doctor的花酒紅色，半重瓣。因此，本試驗(yàn)的研究結(jié)果與夏至等對薔薇科植物的研究結(jié)果即薔薇屬植物的遺傳多樣性較高[10]一致。同時本試驗(yàn)結(jié)果表明，在對藤本月季分類時不能簡單地依靠其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行分類。

對所篩選出的多態(tài)性較高的引物分析表明，二核苷酸重復(fù)序列較多，其中A、C或A、G及C、T組合的多態(tài)性較高，這與楊帆利用ISSR對17份薔薇屬植物親緣關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)富含AC、AG組合的二核苷酸重復(fù)序列多態(tài)性較高結(jié)果[3]一致。表明在對薔薇屬特別是月季品種之間親緣關(guān)系鑒定選用富含AG、AC或AT組合的引物是可取的。

通過對38個藤本月季品種的遺傳多性的分析及分子身份證的構(gòu)建，可以為今后藤本月季的遺傳育種及其開花機(jī)理，花色、花型等方面進(jìn)行深入研究提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時，對藤本月季的新品種的鑒定和保護(hù)提供理論方法的借鑒，可以更加快速地對未知品種進(jìn)行認(rèn)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱秀珍，張佐雙. 中國月季[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2006：1-4.

[2]周俐宏，張金柱，李?振，等. 利用ISSR揭示不同類型月季遺傳多樣性[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（2）：311-315.

[3]楊?帆，曾?麗，葉?康，等. 17份薔薇屬植物的親緣關(guān)系的形態(tài)學(xué)和ISSR分析[J]. 植物研究，2011（2）：193-198.

[4]季春娟. 部分薔薇屬種質(zhì)資源親緣關(guān)系ISSR分析及‘平陰玫瑰的適應(yīng)性種植[D]. 上海：上海交通大學(xué)，2010.

[5]劉?燕. 利用RAPD和ISSR技術(shù)對13個觀賞桃品種的遺傳多樣性分析[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[6]劉?君，趙?琴，楊志民. ISSR分子標(biāo)記對9種狗牙根的鑒定分析[J]. 草業(yè)學(xué)報，2012，21（6）：159-165.

[7]劉?振，趙?洋，楊培迪，等. SSR、SRAP、ISSR分子標(biāo)記在茶樹品種親本鑒定上的比較分析[J]. 茶葉科學(xué)，2014（6）：617-624.

[8]鄭海燕，粟建光，戴志剛，等. 利用ISSR和RAPD標(biāo)記構(gòu)建紅麻種質(zhì)資源分子身份證[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（17）：3499-3510.

[9]趙凱歌. 用形態(tài)標(biāo)記和分子標(biāo)記研究蠟梅栽培種質(zhì)的遺傳多樣性[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[10]夏?至，周?艷，王璐靜，等. 月季花、玫瑰及其近緣種ISSR分析與鑒定[J]. 中草藥，2016，47（24）：4433-4438.