農桿菌介導的浸花法轉化甘藍型油菜過程中柱頭頂端開裂時期的確定

王寧寧 王偉杰 王玉康 曹維 李明 Sundus Zafar 胡茂龍 浦惠明 譚小力

摘要：農桿菌介導的浸花法（floral-dip）是一種簡便、快速、高效、重復性好、穩(wěn)定性高的非組織培養(yǎng)的遺傳轉化法，在擬南芥中已得到了廣泛的應用，但由于諸多因素的影響，其在油菜中的轉化效率受到了很大的制約。以甘藍型油菜為研究對象，通過對雌蕊柱頭開裂時間的研究，發(fā)現(xiàn)即將開放的10～15個花苞的柱頭是裂開的，此時最有利于農桿菌進入子房室完成轉化。對這部分花蕾進行浸花法轉化，得到的T1代種子發(fā)芽后通過除草劑篩選獲得抗性轉基因植株，進一步對這些植株進行PCR驗證，其陽性率高達72.7%。該研究能進一步提高農桿菌轉化效率，實現(xiàn)甘藍型油菜更有效的遺傳轉化。

關鍵詞：甘藍型油菜;浸花法;柱頭開口;轉化效率;農桿菌

中圖分類號： S634.301文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0114-03

收稿日期：2018-06-30

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2016YFD0100305）。

作者簡介：王寧寧（1991—），男，山東濟南人，碩士研究生，研究方向為甘藍型油菜功能基因組學。E-mail：wnn517tdx@163.com。

通信作者：譚小力，博士，研究員，研究方向為植物細胞中油脂合成代謝調控的關鍵因子和網(wǎng)絡調控、多倍體植物功能基因組研究策略的建立、外源基因在植物中高水平表達及合成生物學平臺的構建。E-mail：xltan@ujs.edu.cn。

油菜是四大油料作物之一，位居全球五大經(jīng)濟作物之列，是食用植物油和蛋白的重要來源。在油菜的遺傳轉化研究中，科研人員越來越青睞應用基因工程改良油菜品種，隨著轉基因技術的發(fā)展，用于外源基因的遺傳轉化方法越來越多，大體可分成2類：一類是農桿菌介導的遺傳轉化法;另一類是外源基因直接導入法，如基因槍法、聚乙二醇（PEG）介導法、電擊法、激光微束穿刺法、顯微注射法和花粉管通道法等[1-5]。其中農桿菌介導法在油菜的遺傳轉化中運用得最多。1985年，Horsch首次利用根癌農桿菌介導法獲得轉基因甘藍型油菜[6]。農桿菌介導的浸花法轉化是由真空滲透（vacuum infiltration in planta）轉化法[7-8]簡化而來的[9-10]，只需將植株的花序浸泡在農桿菌轉化液中幾分鐘，然后等種子成熟后即可通過篩選得到轉基因的種子[11]。付紹紅等在對甘藍型油菜進行浸花法轉化后，通過GUS（-葡萄糖苷酸酶）和GFP（綠色熒光蛋白）報告基因的瞬時表達檢測發(fā)現(xiàn)，在轉化植株未受傷的葉片表面、子房表皮、蜜腺、柱頭均檢測到GUS活性或GFP蛋白表達[12]。這說明農桿菌有可能通過以上部位進入受體植株細胞完成轉化過程。之前的研究表明，農桿菌介導的浸花法轉化主要侵染的是雌蕊而不是雄蕊，雌蕊中的胚珠是轉化的靶細胞[13]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥的子房室不總是關閉，卵細胞發(fā)育突出，會延伸成瓶狀結構并在頂部開口，花發(fā)育后期子房室頂部閉合。轉化一般在花開放前5～10 d進行，此時雌蕊開放，農桿菌得以進入子房并將T-DNA轉移到卵細胞[14]。油菜的發(fā)育與擬南芥類似，胚珠在最初發(fā)育階段，先形成1個細胞環(huán)，進而形成1個頂端開口的瓶狀結構，結構的頂端約在開花前3 d形成柱頭，隨后頂端開口閉合，在此之前轉化都有可能發(fā)生[15]?；ㄩ_放后短時間內即完成授粉受精過程且柱頭頂端已經(jīng)閉合，此時的雌蕊已不適合進行轉化。因此，利用農桿菌介導的浸花法進行轉化時往往選擇未開放的花蕾。本研究中，筆者通過對未開放花的雌蕊柱頭開裂時間的研究，探究了農桿菌進入雌蕊子房室的最佳時間，從而能進一步提高農桿菌轉化效率，實現(xiàn)甘藍型油菜更有效的遺傳轉化。

1?材料與方法

1.1?材料

以甘藍型油菜中雙11為研究材料，材料由筆者所在實驗室提供。含有攜帶Bar基因的質粒的農桿菌，菌種由筆者所在實驗室提供。試驗時間：2018年4月;試驗地點：江蘇大學生命科學研究院油菜試驗田。

1.2?方法

1.2.1?雌蕊的固定及觀察

取正常生長的油菜開花期待開放的花蕾，從靠近已開放花朵的第1個花蕾開始，由下至頂端依次取樣并編號，將未開放的第1個花蕾命名為01號，第2個花蕾命名為02號，依次往上取樣（對應的雄蕊編號分別為C01、C02……）。將花萼、花瓣及雄蕊去除，測量雌蕊長度并記錄，然后將雌蕊置于福爾馬林-醋酸-乙醇（FAA）固定液中[16]，于4 ℃固定24 h。固定好后用掃描電鏡觀察柱頭開口時間的差異情況。

1.2.2?農桿菌介導的浸花法轉化油菜

將含有攜帶Bar基因的質粒的農桿菌通過浸花法轉化甘藍型油菜中雙11。浸花前將已開放的花剪掉，保留10～15個待開放的花蕾用于浸花，將其余幼嫩的花蕾剪掉。將攜帶轉化載體的農桿菌接種于250 mL LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)至D600 nm為0.8～1.0左右，離心后用250 mL MS液體培養(yǎng)基重懸，并加入乙酰丁香酮、6- 芐氨基腺嘌呤（6-BA）及SilwetL-77。將花蕾浸入農桿菌懸浮液中浸泡5 min，浸花完成后套上羊皮紙帶，花期結束后摘掉紙袋。待種子成熟后收獲、儲存[17]。

1.2.3?陽性轉化株的篩選

用于轉化的載體上攜帶有1個抗除草劑的篩選標記基因Bar，如圖1所示，因而可以利用除草劑進行轉基因植株的篩選。將浸花后收獲的T1代油菜種子播種于托盤中，待幼苗長出1張真葉時通過噴灑除草劑篩選出陽性的轉化株[18]。提取除草劑篩選后存活下來的油菜幼苗葉片基因組進行PCR驗證，PCR擴增片段位置如圖1所示，PCR擴增的引物序列如下：

Bar-F：5′-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAAA-3′;

Bar-R：5′-CTGCACCATCGTCAACCACTA-3′。

2?結果與分析

2.1?柱頭開裂情況觀察

利用掃描電鏡對FAA固定的甘藍型油菜雌蕊柱頭進行觀察，發(fā)現(xiàn)并不是所有未開放花蕾的雌蕊柱頭都是開口的，如圖2所示，在所有掃描的雌蕊柱頭中，只有編號靠前的10個左右的柱頭是開口的，即最接近開放的10朵左右的花蕾柱頭是開口的，這一部分花蕾在進行農桿菌浸花時，農桿菌最有可能通過柱頭上的開口進入子房內部，進而完成轉化。

如圖3所示，通過對雌蕊長度的測量，可以發(fā)現(xiàn)柱頭開口的這一部分（C01～C12）雌蕊較其他雌蕊長度略長，發(fā)育較早，距離開花的時間也相對較短，便于進行轉化。

2.2?陽性轉化株的篩選

對浸花法轉化得到的油菜種子萌發(fā)后的幼苗噴灑除草劑處理，部分油菜幼苗存活了下來，如圖4所示。由于進行轉化的載體上含有除草劑抗性基因Bar，其轉基因植株對除草劑具有一定程度的抗性。因此這部分存活下來的油菜幼苗很有可能是轉化成功的轉基因植株。

2.3?陽性轉化株的分子鑒定

提取存活油菜幼苗的葉片基因組，PCR擴增Bar基因（圖1）中444 bp的片段，由此來進一步驗證存活的幼苗是否為轉基因植株。如圖5所示，存活植株中有很大一部分都擴增出了與質粒對照相同大小的條帶，說明這部分植株確實為轉基因植株，存活植株的陽性率約為72.7%。以上結果表明，對柱頭開口時間的正確把握，對于提高油菜遺傳轉化效率具有重要作用。

3?討論

隨著甘藍型油菜研究的不斷深入，建立一種高效、便捷的油菜遺傳轉化體系是非常有必要的。農桿菌介導的浸花法是一種簡便、快速、高效、重復性好、穩(wěn)定性高的非組織培養(yǎng)的遺傳轉化法，對于甘藍型油菜的研究具有重要意義，已經(jīng)應用到了油菜的遺傳轉化中[19-22]，但在實際應用中存在的各種因素導致油菜轉化效率非常低。本試驗通過掃描電鏡，對油菜雌蕊柱頭的開口時間進行了觀察，發(fā)現(xiàn)并不是所有未開放花蕾的雌蕊柱頭都是開口的，只有最接近開放的10～15個的花蕾柱頭是開口的。這一部分花蕾在進行農桿菌浸染時，由于雌蕊頂端有開口，便于農桿菌進入子房內部，進而完成轉化。對浸花法獲得的油菜種子萌發(fā)后的幼苗進行除草劑篩選及PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)存活下來的油菜幼苗為轉基因植株的比例達到72.7%，這一結果也證實了該方法的可靠性，即通過正確把握油菜雌蕊的開口時間，選擇最恰當?shù)挠筒嘶ɡ龠M行浸花轉化，將會大大提高油菜的遺傳轉化效率，對甘藍型油菜的研究具有重要意義。

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