產ε-聚賴氨酸菌株的篩選、鑒定及發酵

王昭君　趙志軍　孫俊松　史吉平　王紹明

摘要：分別在培養基中添加2 g/L ε-聚賴氨酸（ε-PL）和復合抗生素抑菌劑，結合ε-聚賴氨酸與亞甲基藍形成透明圈的現象初篩產ε-PL的菌株，根據ε-聚賴氨酸與道夫根試劑的特殊沉淀反應現象復篩獲得5株菌株，經生理生化試驗和16S rDNA分析鑒定，5株菌株中包括1株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），1株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），1株鏈霉菌屬（Streptomyces sp.，未鑒定到種）菌株，1株糖多孢屬（Saccharopolyspora sp）菌株，1株白色鏈霉菌（Streptomyces albulus），其搖瓶發酵ε-聚賴氨酸產量分別為0.06、0.08、0.70、0.82、1.56 g/L;采用2階段法對wzj4、wzj5進行5 L發酵罐發酵，結果發現，其ε-聚賴氨酸最大產量分別為2.54、6.99 g/L。凝膠色譜分析表明wzj5發酵液中ε-聚賴氨酸分子量大小與對照品相近，最小抑菌濃度為250 μg/mL，對大腸桿菌的抑菌效果良好。

關鍵詞：ε-聚賴氨酸;ε-PL生產菌株;不同類型;篩選;鑒定;發酵;性能分析

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0291-06

收稿日期：2018-05-25

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：31300048）。

作者簡介：王昭君（1991—），女，新疆奎屯人，碩士研究生，研究方向為綠洲農業生態。E-mail：wzjshz@163.com。

通信作者：趙志軍，博士，副研究員，研究方向為代謝工程，E-mail：zhaozj@sari.ac.cn;王紹明，教授，研究方向為生態學，E-mail：westwild@vip.sina.com。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）是由25～35個L-賴氨酸單體通過α-COOH和ε-NH2脫水縮合而成的氨基酸同型聚合物，相對分子質量通常為3 500～4 500 Du[1]。ε-PL具有廣泛的抑菌譜，并且穩定性強，安全高效，目前我國已經批準其作為食品防腐劑[2]，在國外更是已被廣泛應用。

近年來，我國研究人員對ε-PL產生菌的篩選[3]、發酵[4]、產物鑒定[5]、提取[6]、應用[7]等進行了大量研究。傳統的篩選工作通過鑒定搖瓶發酵液中的產物來確定所篩菌株是否能夠產生ε-聚賴氨酸，篩選過程費時費力，且效率極低。Nishikawa等采用一種含酸性染料polyR-478的培養基篩選ε-PL產生菌，獲得了大量ε-PL產生菌，包括鏈霉菌屬（Streptomyces）、北里胞菌屬（Kitasatosporia）、香柱菌屬（Epichloe）等[8];該方法大大提高了篩選效率，且可獲得不同菌種的ε-PL產生菌，但因為所用染料試劑的停產，該方法未得到普及[9]。目前，我國研究人員多用亞甲基藍平板篩選法分離篩選ε-PL產生菌，如黃莉等利用含K2Cr7O7和亞甲基藍的平板篩選出一株Streptomyces griseolus，其ε-PL產量為0.808 g/L[10]。張波用同樣的方法從四川省成都市郊區土壤中篩選獲得一株ε-PL產量為1.893 g/L的不吸水鏈霉菌Streptomyces ahygroscopicus SAC23[11]。

江南大學[12]、天津科技大學[13]、南京工業大學[14]等單位在ε-PL菌種篩選與發酵優化方面做了大量的研究工作。張超等篩到一株Streptomyces sp. M-Z18，該菌的搖瓶ε-PL產量為0.2 g/L，其所在課題組以Streptomyces sp. M-Z18為出發菌株采用物理化學誘變、原生質體融合、基因組重排（genome shuffling）技術等一系列方法進行ε-PL高產菌株選育，2007年以該菌株為出發菌株進行紫外誘變得到一株高產ε-PL的菌株C-18，其搖瓶ε-PL產量為1.23 g/L[15]。任喜東等提出了一種酸性pH值沖擊策略，先將pH值調至5.0，對pH值沖擊階段進行預適應，再調節pH值至3.0，以調控菌體代謝活力，最后調節pH值至4.0為ε-PL的積累提供最適條件，在此條件下，5 L發酵罐的發酵產量達54.70 g/L，不僅達到了商業生產要求，甚至高于日本工業生產用菌Streptomyces albulus stain 410的報道產量（48.3 g/L）[16-17]。

本研究在篩選培養基中添加ε-PL和復合抗生素抑菌劑，結合ε-PL與亞甲基藍的靜電作用形成透明圈的特性，篩選不同類型的ε-PL生產菌株，并在搖瓶及5 L發酵罐中進行發酵，對不同類型ε-PL生產菌株產ε-PL的性能進行考察。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?樣品

2016年9月從上海市郊區采集土樣，除去表層土，取距表層5～10 cm土壤100 g，裝入已滅菌的牛皮紙袋中，于室溫下自然風干3～10 d，碾碎過篩后，在50 ℃下烘1 h，取1 g土樣加入10 mL滅過菌的0.005 mol/L磷酸緩沖液[pH值為7.0，其中含6.00%蛋白胨和0.05%十二烷基硫酸鈉（SDS）]中，50 ℃下振蕩10 min[18]。

1.1.2?試劑

ε-PL對照品購自鄭州拜納佛生物工程股份有限公司;酶及引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司;DNA提取試劑盒購買自碧云天生物技術有限公司;其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3?儀器

PCR儀（BIO-RAD），高壓蒸汽滅菌鍋（SANYO），電泳儀（BIO-RAD），SBA-40D生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所），5 L發酵罐（Sartorius Stedim Biotech GmbH），高效液相色譜儀（島津公司）等。

1.1.4?培養基及溶液

分離培養基（SG培養基）：甘油1%，酵母膏0.01%，KH2PO4 0.025%，NaH2PO4·2H2O 0.088%，MgSO4·7H2O 0.025%，（NH4）2SO4 0.066%，ZnSO4·7H2O 0.005%，FeSO4·7H2O 0.001%，瓊脂1.5%，pH值7.5。115 ℃，滅菌15 min。

鏈霉菌篩選（ISP2）培養基：酵母浸膏0.4%，麥芽浸膏1%，葡萄糖0.4%，瓊脂1.5%，微量鹽溶液1 mL，pH值7.2。115 ℃，滅菌15 min。

種子培養基及發酵培養基（M3G）：葡萄糖5.000 0%，酵母粉0.500 0%，（NH4）2SO4 1.000 0%，K2HPO4·3H2O0.104 8%，KH2PO4 0.136 0%，10倍濃縮鹽溶液（MgSO4·7H2O 0.0500%，FeSO4·7H2O 0.0030%，ZnSO4·7H2O0.004%）100 mL，pH值6.8。葡萄糖單獨滅菌。

LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂2 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。121 ℃，滅菌20 min。

微量鹽溶液：FeSO4·7H2O 0.1 g，MnCl2·4H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，加水定容至1 L。

復合抗生素抑菌劑：將10 mg放線菌酮、10 mg制霉菌素、20 mg萘啶酮酸鈉分別平鋪在三角瓶中，覆蓋乙醚，使乙醚沒過抗生素粉末，用培養基封口膜封口放入通風櫥中待乙醚揮發干后，轉至超凈臺上，加入定量無菌水，于45 ℃下水浴溶解后過0.2 μm濾膜。制霉菌素在pH值為7.2時溶解不完全，需用1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至11.0，完全溶解后用鹽酸中和滴定，使pH值回復至7.2。

0.1 mol/L磷酸緩沖液：稱取35.820 g Na2HPO4·12H2O，15.605 g NaH2PO4·2H2O，分別定容至1 L，相互滴定至pH值為6.6。

道夫根試劑（DR試劑）：參照文獻[19]配制。

1.2?方法

1.2.1?產ε-PL菌株初篩

1.2.1.1?ε-PL耐受菌株的篩選

首先對土樣進行預處理，具體為大致去除土樣中的雜物，風干后碾碎過篩，烘干。取1 g 預處理過的土樣加入10 mL無菌水中，30 ℃、100 r/min振蕩15 min后靜置30 min，吸取上清液稀釋適當倍數后涂布于含2 g/L ε-PL的LB分離培養基平板上。

1.2.1.2?復合抗生素抑菌劑平板篩選

據文獻[20]報道，產ε-PL的菌種大多屬于北里胞菌屬、鏈霉菌屬等，其中鏈霉菌屬的菌種產量普遍較高。萘啶酮酸對細菌的抑制效果較好，制霉菌素能夠抑制真菌，放線菌酮能夠抑制霉菌和酵母等，因此添加抑制細菌、霉菌、酵母和真菌的抗生素于ISP2培養基平板上進行放線菌株的篩選。在已滅菌的ISP2平板中加入復合抗生素抑菌劑，倒板涂布，篩選產ε-PL的放線菌株。

1.2.1.3?透明圈篩選

挑取ε-PL耐受平板和復合抗生素篩選平板上的菌落，接種至含0.003%亞甲基藍的SG培養基平板上30 ℃培養7 d[8]。亞甲基藍是一種堿性染料，菌落分泌的帶正電荷的物質（ε-PL）會由于靜電作用排斥亞甲基藍，進而形成透明圈，且帶正電荷物質的濃度越高，透明圈越大[21]。挑取有明顯透明圈的單菌落進行保存，用于復篩。

1.2.2?復篩

將初篩得到的細菌接種至盛有30 mL LB液體培養基的250 mL搖瓶中，在30 ℃、200 r/min下發酵84 h;轉接到盛有30 mL M3G培養基的250 mL搖瓶中，在30 ℃下發酵96 h，收集發酵液在7 000 r/min條件下離心10 min，用DR試劑檢測發酵產物是否存在ε-PL。該反應很靈敏，可以有效檢測出發酵液中的ε-PL[22]。

1.2.3?生理生化鑒定

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第9版）、《放線菌分類基礎》及《鏈霉菌鑒定手冊》對復篩得到的菌株進行初步鑒定。

1.2.4?16S rDNA鑒定

取搖瓶培養7 d后的菌液，采用基因組提取試劑盒提取基因組DNA，并采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將得到的16S rDNA序列與Gen Bank數據庫中相關種屬的序列進行比較，構建系統發育樹。

1.2.5?高效液相色譜產量測定

高效液相色譜（HPLC）采用國標法（GB/T 5009.124）進行：C18柱，流動相為8%乙腈，流速為0.4 mL/min，檢測波長為215 nm，進樣體積 為20 μL，溫度為40 ℃。

1.2.6?菌株生物量測定

采用干質量法測定菌株生物量（DCW）。每隔12 h取5 mL發酵液樣品，在7 000 r/min轉速下離心10 min，沉淀（即菌絲體）經蒸餾水洗滌3次后放入干燥清潔且已知質量的培養皿中，于60 ℃下烘干至恒質量，稱質量得菌體干質量。重復測定3次，取平均值。

1.2.7?發酵產物的分子量分析

使用凝膠滲透色譜確定發酵液中ε-PL分子量大小。參考色譜條件：凝膠柱為TSK-gelG2000SWXL;檢測溫度為35 ℃，檢測波長為210 nm，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL;流動相，乙腈 ∶水=20 ∶80（體積比），含三氟乙酸1 mL/L[15，23-24]。

1.2.8?最小抑制濃度的確定

以鄭州拜納佛生物工程股份有限公司生產的ε-PL為對照，從wzj5發酵液提取得到的ε-PL固體粉末作為試驗樣品，按0～250 μg/mL不同的9個濃度梯度添加到培養基中，將稀釋了適當倍數的大腸桿菌BW25113菌液涂在平板上，驗證ε-PL的抑菌效果。

2?結果與分析

2.1?產ε-PL菌株的初篩

2.1.1?ε-PL耐受菌株和產ε-PL菌株篩選

以往的研究經驗表明，目標物的生產菌株通常對目標物具有一定的耐受性，依據這一特性，本研究嘗試通過篩選ε-PL的耐受菌株來獲得產ε-PL的菌株。將從ε-PL耐受平板上篩選出的菌落接種至含0.003%亞甲基藍的SG平板上，篩選出wzj1、wzj2菌株。圖1為通過該原理篩選出的2株在含亞甲基藍的SG培養基上形成透明圈的菌株wzj1、wzj2，根據菌落長出的時間與其濕潤、黏稠、易挑起的形態特征初步判斷可能是細菌。

2.1.2?復合抗生素抑菌劑平板篩選

將從復合抗生素抑菌劑平板上篩選出的菌落接種至含0.003%亞甲基藍的SG平板上，篩選出wzj3、wzj4、wzj5等3株透明圈較大的菌株（圖2），其中wzj5菌株形成的透明圈明顯大于其他2株菌株。從形態特征上看，這3株菌株不同于wzj1、wzj2菌株，其菌落干燥，質地緊密而不蔓延，不易挑起，初步判斷可能是真菌或者放線菌。

2.2?產ε-PL菌株的復篩

據文獻報道，ε-PL在酸性（pH值為2～5）條件下能夠與DR試劑發生特異性反應生成橘紅色沉淀（BiI3）（ε-PL·HI）[25]。本試驗結果（圖3）表明，wzj1、wzj2、wzj3、wzj4、wzj5菌株的發酵液均能夠與DR試劑發生反應生成橘紅色沉淀。其中，wzj1、wzj2菌株的發酵液與DR試劑反應產生的沉淀偏少，而wzj3、wzj4、wzj5菌株的發酵液與DR試劑反應產生的沉淀較多。

2.3?ε-PL產生菌的鑒定

2.3.1?生理生化鑒定

傳統微生物分類鑒定的主要依據是微生物的形態學特征、生理生化反應特征等，可初步判定其種屬。5株菌株在LB固體培養基上的菌落形態見圖4-a，它們在顯微鏡下的個體形態如圖4-b所示，形態特征描述與生理生化試驗結果見表1。根據試驗結果推測，菌株wzj1、wzj2歸屬于芽孢桿菌屬;wzj3、wzj4、wzj5歸屬于鏈霉菌屬。

2.3.2?16S rDNA鑒定

從Gen Bank數據庫中通過Blast查找與5株菌株相似的16S rDNA序列，并通過MEGA軟件與菌株wzj1、wzj2、wzj3、wzj4、wzj5的16S rDNA序列進行比對，構建以16S rDNA全序列為基礎的系統發育樹。結果（圖5）表明，菌株wzj1為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），wzj2為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），wzj3屬于鏈霉菌（Streptomyces sp，未鑒定到種），wzj4為糖多孢菌（Saccharopolyspora sp），wzj5為白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）。

2.4?ε-PL產量測定

2.4.1?搖瓶發酵

圖6顯示了5株菌株在搖瓶發酵過程中ε-PL濃度的變化，可以看出，wzj1、wzj2均在發酵42 h時達到其最高ε-PL產量，wzj1產量為0.06 g/L，wzj2產量為0.08 g/L，在發酵42 h后，ε-PL濃度緩慢遞減;wzj3在搖瓶發酵108 h時，ε-PL濃度最高，為0.70 g/L;wzj4在發酵84～108 h時快速積累ε-PL，在108 h達到0.82 g/L;wzj5發酵產生的ε-PL含量明顯高于其他4株菌株，且在搖瓶發酵96 h時ε-PL產量達到最大值，為1.56 g/L。

2.4.2?發酵罐發酵

選取搖瓶發酵中ε-PL產量較高的wzj4菌株和wzj5菌株進行發酵罐發酵。發酵調控采取2階段法：第1階段為菌體生長階段，初始pH值為6.8;第2階段為ε-PL合成階段，pH值維持4.0不變。

圖7-a是wzj4菌株發酵罐發酵過程的參數變化情況，可以看出，第1階段（0～96 h）菌體濃度與條件呈負相關關系，菌體濃度大幅度增長，同時菌體吸收葡萄糖代謝產酸導致pH值不斷下降。第2階段（96～168 h），維持pH值為4.0。此時在酸性條件下菌體生長受到抑制，菌體濃度逐漸趨于穩定，胞內積累的ATP不再主要是用于菌體生長，而是被用于ε-PL 合成酶功能的發揮，有利于ε-PL的積累。從132 h開始，ε-PL產量增長速度變慢，在156 h時ε-PL產量達2.54 g/L。

圖7-b給出了wzj5在發酵過程中各參數的變化趨勢，其中0～60 h為菌體的生長階段，在產ε-PL的第2階段（60～168 h）中，在發酵96～120 h時ε-PL積累速率較高，并在發酵120 h時達到最大積累量6.99 g/L。

2.5?平均分子量大小的確定

參照韓岱等的ε-PL提取方法[26]，對發酵液中的ε-PL進行提取。以鄭州拜納佛生物工程股份有限公司的ε-PL作為對照，對從wzj5菌株發酵液中提取的ε-PL樣品進行凝膠滲透色譜比較分析。結果（圖8）表明，對照在保留時間 為6.9 min 時有最大峰，且樣品在此處也存在最大峰，因此確定發酵液中存在與對照分子量大小相近的ε-PL。

2.6?最小抑菌濃度

由圖9可知，從wzj5發酵液中提取的ε-PL具備與對照品基本相近的抑菌能力，最小抑菌濃度為0.25 mg/mL。

3?結論與討論

ε-PL是一種新型的天然高效生物防腐劑，其菌種選育一直受到研究者的廣泛關注。本研究采用不同的方法篩選獲得5株不同類型的產ε-PL菌株，其中2株芽孢桿菌分別是Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus cereus，ε-PL產量分別是0.06 g/L和0.08 g/L。前期有文獻報道，芽孢桿菌產ε-PL的搖瓶產量為0.036～0.083 g/L[5，27]，且已有研究者對產ε-PL芽孢桿菌的發酵條件作了初步研究[28]。芽孢桿菌具有發酵周期短，易培養的優點，對于ε-PL生產來說，仍具有一定的開發潛力。此外，本研究還篩選到一株糖多孢菌屬的菌株wzj4，其搖瓶最大產量為0.82 g/L，發酵罐發酵最大產量為2.54 g/L，該結果為本研究首次報道。

ε-PL產生菌主要集中在鏈霉菌屬[5，29]，包括灰橙鏈霉菌[30]、禾栗鏈霉菌[31]、稠李鏈霉菌[32]等。本研究篩選獲得2株鏈霉菌屬菌株，其中wzj3的搖瓶最大產量為0.70 g/L，wzj5的搖瓶最大產量為1.56 g/L，其發酵罐發酵最大產量為6.99 g/L，具有較好的產ε-PL潛力。菌株wzj5的ε-PL產量較高，因此提取其發酵液中ε-PL進行凝膠色譜分析，結果表明，ε-PL的分子量大小與鄭州拜納佛生物工程股份有限公司生產的ε-PL對照品一致，最小抑菌濃度為250 μg/mL。

ε-PL作為一種新型高效安全的天然防腐保鮮劑，具有廣闊的應用前景，但與其他生物防腐劑相比，目前ε-PL的生產成本和市場價格仍然偏高，后期可采用分子生物學和發酵調控優化等手段，進一步提高ε-PL的產量和得率;另外，ε-PL是聚合度在25～30范圍內的混合物，其提取與分離工藝比較復雜，仍有較大的技術提升空間。本研究聚焦在產聚賴氨酸菌株的篩選上，并在發酵、產物提取分離和產物性能檢測方面進行了初步研究，可為后期進一步的菌株改良、發酵條件優化、提取工藝優化等研究奠定實踐基礎。

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