水通道蛋白基因在子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜中的表達及其意義

賈利平，王炳淑， 劉玉珠， 周小飛，王發(fā)輝

子宮腺肌病(adenomyosis，ADS)是一種病理狀態(tài)，其特征是子宮內(nèi)膜組織存在異常組織如上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞[1-3]。根據(jù)術(shù)中和組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，ADS可歸為4種不同的類型，即彌漫性、硬化性、結(jié)節(jié)性和囊性。大約2/3的ADS女性患有月經(jīng)過多、痛經(jīng)和子宮增大的癥狀，在低生育力的女性中占有很高比例[4-5]。但是，ADS的病因和發(fā)病機制仍然知之甚少。子宮腺肌病是一種雌激素依賴性炎性反應(yīng)疾病。除了激素調(diào)節(jié)之外，還報道了許多其他因素，包括炎性細(xì)胞因子聚集、神經(jīng)支配重塑、血管生成增加。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類存在于細(xì)胞膜的小分子蛋白，研究表明水通道蛋白家族有廣泛的功能：促進水分子的快速被動運輸；調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡；促進細(xì)胞遷徙；調(diào)節(jié)脂肪代謝；神經(jīng)信號傳導(dǎo)等[6-8]。AQP不僅在組織水轉(zhuǎn)運中起到重要作用，也參與了細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、吞噬和神經(jīng)信號傳導(dǎo)等過程。研究證實AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宮內(nèi)膜異位癥中的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中都有表達[9]。同時研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜異位癥中AQP1主要表達于在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的微血管和小血管上，而AQP2、AQP5、AQP8主要表達于在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的腺上皮和腔上皮細(xì)胞上。本研究擬探討AQP1、AQP2、AQP5與AQP8在子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜中的表達及其意義，為子宮腺肌病的治療提供理論依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2019年4月海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦科收治子宮腺肌病患者104例作為ADS組， 78例患有肌瘤或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ度的婦女為對照組。ADS組年齡27～47(37.6±9.3)歲，孕產(chǎn)史G1P1；對照組年齡27～47(37.1±9.1)歲，孕產(chǎn)史G1P1。所有研究對象在生育年齡(25～46歲)進行子宮切除術(shù)，獲取其子宮內(nèi)膜。研究對象在手術(shù)前至少3個月未接受激素治療，且無惡性腫瘤或自身免疫性疾病史。獲取子宮腺肌病患者及對照組子宮內(nèi)膜后，將組織立刻置于-70℃冰箱保存，用于后續(xù)相應(yīng)指標(biāo)的檢測。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)與方法

1.2.1 AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA在子宮內(nèi)膜組織表達的測定：使用InvitrogenTMTRIzolTM試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn))根據(jù)說明從子宮內(nèi)膜組織中提取總RNA。RNA量通過Nano Drop ND-2000分光光度計(光密度260 nm，美國Nano Drop公司生產(chǎn))測量，并使用標(biāo)準(zhǔn)變性瓊脂糖凝膠電泳評估RNA完整性。用PrimeScriptTMRT試劑盒(日本Takara公司生產(chǎn))合成cDNA，并使用SYRT PremixEx TaqTM試劑盒(日本Takara公司生產(chǎn))在Roche LightCycler 480(瑞士Roche公司生產(chǎn))中進行RT-PCR。為檢測子宮內(nèi)膜AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表達水平，本研究使用miRNeasyTMMini試劑盒(德國Qiagen公司生產(chǎn))根據(jù)說明提取總RNA(包括microRNA)。使用miRCURY LNATMUniversal cDNA Synthesis試劑盒Ⅱ(丹麥Exiqon A/S公司生產(chǎn))合成cDNA，并使用miRCURY LNATMExiLENTSYBR-Green Master Mix(丹麥Exiqon A/S公司生產(chǎn))進行RT-PCR。AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表達水平分別歸一化為U6表達水平。使用2-ΔΔCt方法計算相對表達水平。AQP1引物：5'-GCTGGTTTTCTTTGCTAGCCC-3'(正向)和5'-CACCGGCAGGGTCTGTATTC-3'(反向)，AQP2引物：5'-CCGTACGTATCTTTGCCCGTTAG-3'(正向)和5'-CCGTAGCAGGGTCTCGTACG-3'(反向)，AQP5引物：5'-CCTGGACTTCTTTGCCGTGA-3'(正向)和5'-CACCGGCAGGGTCTGTATTC-3'(反向)，AQP8引物：5'-CCGTGATTCTTTGCGGTAGC-3'(正向)和5'-CACCGGCAGGGTCTGTATTC-3'(反向)，U6引物：5'-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3'(正向)和5'-AGGAATCCTTCTGACCCATGC-3'(反向)。

1.2.2 AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白在子宮內(nèi)膜組織表達的測定：使用免疫組織化學(xué)方法檢測AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宮內(nèi)膜組織樣品中的表達。兔抗人AQP1、AQP2、AQP5、AQP8多克隆抗體(1∶800)由美國Cell Signaling Technology公司提供。山羊抗兔二級多克隆抗體(1∶1 000)由Cell Signaling Technology公司提供；DBA試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。常規(guī)進行免疫組織化學(xué)方法檢測AQP1、AQP2、AQP5、AQP8水平。根據(jù)Remmele方法計算免疫反應(yīng)評分。陽性細(xì)胞的百分比評分：無染色評分為(-)，計0分；陽性細(xì)胞<10%，計1分；10%～50%，計2分；51%～80%，計3分；>80%，計4分。染色強度評分：陰性計0分，低強度陽性染色計1分，中等強度陽性染色計2分，強陽性染色計3分。 染色強度分?jǐn)?shù)加上陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)為總分， 0分為陰性染色(-)，2～5分為陽性染色(+)，6分及以上為強陽性(++)。免疫反應(yīng)評分由2位病理科醫(yī)師獨立完成。

2 結(jié) 果

2.1 2組子宮內(nèi)膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表達水平比較 ADS組中在位子宮內(nèi)膜組織AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表達水平高于對照組正常子宮內(nèi)膜(P<0.01)，見表1。

2.2 2組子宮內(nèi)膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達比較 ADS組中在位子宮內(nèi)膜組織AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平高于對照組正常子宮內(nèi)膜(P<0.01)，見表2。

2.3 2組子宮內(nèi)膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 蛋白表達陽性率比較 ADS組中在位子宮內(nèi)膜組織AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 蛋白表達陽性率高于對照組正常子宮內(nèi)膜(P<0.01)，見表3、圖1(見封3)。

表3 2組子宮內(nèi)膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、 AQP8 蛋白表達陽性率比較 [例(%)]

2.4 2組AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白在不同月經(jīng)周期中的表達水平比較 對照組分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平高于增殖期(P<0.01)；ADS組增殖期、分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ADS組增殖期、分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平均明顯高于對照組增殖期、分泌期相應(yīng)蛋白表達水平(P<0.05)，見表4。

3 討 論

子宮腺肌病是指子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)在子宮肌層彌漫性或局限性生長，致子宮肌層細(xì)胞增生肥大。它是一種婦科常見疾病，好發(fā)于30～50歲育齡婦女，發(fā)病率在不同人群有一定差異，不同流行病學(xué)研究統(tǒng)計出的患病率為8%～62%[10]。主要臨床表現(xiàn)有不同程度的繼發(fā)性進行性痛經(jīng)和異常子宮出血，可能導(dǎo)致不孕和早期流產(chǎn)等，嚴(yán)重影響女性的身心健康和生活質(zhì)量。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，超聲和磁共振檢查子宮內(nèi)膜腺肌病的敏感度和特異度均有提高，但目前仍缺乏子宮腺肌病早期診斷的有效方法[11]。近年來，許多學(xué)者對該病的發(fā)病機制進行了深入研究，但子宮腺肌病的病因及發(fā)病機制仍不清楚。

表1 2組子宮內(nèi)膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表達水平比較

表2 2組子宮內(nèi)膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達評分比較分)

表4 2組AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白在不同月經(jīng)周期中的表達水平比較分)

研究表明AQP蛋白家族可能參與ADS的病理過程。AQP蛋白是神經(jīng)營養(yǎng)因子，它具有2種受體，高親和力酪氨酸激酶受體(TRK)A和低親和力p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75NTR)。作為一種多功能神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)劑，AQP蛋白在疼痛、神經(jīng)可塑性、免疫細(xì)胞聚集中有重要調(diào)節(jié)作用[12]。在ADS中，AQP蛋白可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒炎性因子的釋放，進而導(dǎo)致疼痛。研究表明AQP蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥和ADS中異常表達，AQP蛋白參與神經(jīng)支配和疼痛發(fā)生過程。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞可分泌AQP蛋白，并且AQP蛋白通過p75NTR結(jié)合發(fā)揮其對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的作用。P75NTR屬于TNF/FasCD40受體超家族，可通過NF-κB和神經(jīng)酰胺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與其他神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體結(jié)合，影響細(xì)胞生長和凋亡[13-14]。小鼠動物試驗發(fā)現(xiàn)ADS病灶的胚胎干細(xì)胞可以分泌更多的AQP2、AQP5蛋白，其隨著ADS疾病嚴(yán)重程度逐漸增加，AQP2、AQP5蛋白水平逐漸升高。作為一種雌激素依賴性疾病，ADS可以通過抑制卵巢功能或雌激素拮抗作用來治療[15-16]。子宮內(nèi)膜異位癥和正常女性外周血的雌激素水平無顯著差異。然而，在ADS患者中觀察到月經(jīng)血中雌激素水平最高，而在正常女性中觀察到雌激素水平最低。在ADS或子宮內(nèi)膜異位癥病變中發(fā)現(xiàn)高水平的芳香酶(雌激素合成的關(guān)鍵酶)，表明異位子宮內(nèi)膜保留其營養(yǎng)功能。局部分泌的雌激素不僅可以支持異位子宮內(nèi)膜灶的生長和侵襲，還可以促進受雌激素調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子的表達。AQP蛋白受到雌激素的調(diào)節(jié)，研究表明卵巢切除的成年雌性小鼠子宮內(nèi)AQP蛋白明顯低于對照組[17-18]。在雌激素替代后，AQP蛋白和mRNA水平增加至卵巢切除術(shù)前的水平。雌激素周期或外源性雌激素可增加倉鼠子宮中AQP蛋白的表達。研究還發(fā)現(xiàn)，17b-雌二醇促進ADS胚胎干細(xì)胞分泌AQP蛋白，其水平相應(yīng)增加。因此，ADS病變中雌激素分泌增加和對雌激素相對高的敏感性可能是AQP蛋白高表達的原因。本研究結(jié)果顯示，ADS組中子宮內(nèi)膜組織AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA及蛋白表達水平高于對照組，這與上述報道相符合，同時提示，子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表達水平升高，其參與了子宮腺肌病病理過程。本研究同時發(fā)現(xiàn)，對照組分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平高于增殖期(P<0.01)，ADS組增殖期、分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)。這說明AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜表達失去月經(jīng)周期性，這可能是導(dǎo)致子宮腺肌病的原因。

綜上所述，子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表達水平升高，其參與了子宮腺肌病病理過程；AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜表達失去月經(jīng)周期性，這可能是子宮腺肌病的原因之一。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

賈利平：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫及修改；王炳淑：質(zhì)量控制、免疫檢測；劉玉珠：課題指導(dǎo)；周小飛、王發(fā)輝：病例收集