microRNA-30d/Runx2影響大鼠牙周輔助加速成骨正畸治療模型成骨活性的研究

郝鑫，張媛媛，陳菊芳，劉明瑾，田玉樓

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸二科，遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所正畸教研室，中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實驗室，沈陽 110002）

正畸治療的時間取決于錯牙合畸形嚴(yán)重程度、患者的個體差異和配合性及正畸治療手段等因素。較長的正畸治療期可能增加牙齒脫鈣、牙周炎伴牙槽骨吸收、牙髓炎、牙根吸收等并發(fā)癥的風(fēng)險［1-2］。因此，在糾正咬合的基礎(chǔ)上，加速牙齒移動，縮短治療周期，成為正畸臨床醫(yī)生需要解決的問題。牙周輔助加速成骨正畸治療（periodontally accelerated osteogenic orthodontics，PAOO）基于骨皮質(zhì)切開后產(chǎn)生的短暫脫礦—再礦化的局部加速現(xiàn)象［3］，縮短正畸治療時間的同時，又增加了正畸治療的安全性與應(yīng)用范圍［4］。

本研究通過建立大鼠PAOO牙齒移動動物模型，觀察正畸牙齒加速移動及傳統(tǒng)移動過程中Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）及microRNA-30d的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1%戊巴比妥鈉、4%多聚甲醛、EDTA脫鈣液、Trizol試劑、HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒、QuantiFast?SYBR?Green PCR試劑盒（中國瑞沃德生命科技有限公司）；定值拉簧（美國Ormco公司）；體視顯微鏡（中國麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；超微量分光光度儀、Ⅱ型熒光定量PCR儀（瑞士羅氏集團）。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物及分組：選用清潔級、健康雄性SD大鼠21只，8周齡，體質(zhì)量（300±20）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。分籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂養(yǎng)SPF級全價顆粒維持鼠料。室溫（20 ℃）、12 h/d照明下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗操作。將21只SD大鼠隨機分為傳統(tǒng)牙齒移動組（TM組，n=9），PAOO牙齒移動組（PAOO＋TM組，n=9），空白對照組（不做任何處理，n=3）。TM組大鼠僅行正畸牽引（F=50 g），PAOO+TM 組除行同等力量牽引外，行牙周輔助加速成骨，以上2組大鼠又按加力時間長短分為3、7、14 d 3個亞組。

1.2.2 大鼠牙齒移動模型建立：TM組和PAOO+TM組大鼠行全身麻醉（1%戊巴比妥鈉4 mL/kg腹腔注射）后，用牙科高速手機配裂鉆車針在2個上頜切牙的牙根中部鉆孔，用0.25 mm正畸不銹鋼結(jié)扎絲穿過牙根上的孔洞，將上頜切牙結(jié)扎在一起增強支抗，并防止中切牙不斷萌出。切開PAOO+TM組大鼠上頜第一磨牙頰、腭側(cè)及近中牙槽黏膜，暴露牙槽骨面，用高速金剛砂車針在生理鹽水冷卻下距牙槽嵴頂約1 mm處打0.5 mm3的小孔，穿透骨皮質(zhì)全層。將0.2 mm的結(jié)扎絲從TM組和PAOO+TM組大鼠的第一、二磨牙間穿過，上頜第一磨牙牙頸部平齊齦緣處的頰腭面及近中面磨出固位溝，將結(jié)扎絲安置于固位溝內(nèi)，將拉簧固定在大鼠上頜第一磨牙與切牙之間，使拉簧拉伸，牽引第一磨牙近中移動。矯治力通過鎳鈦拉簧提供，測力計控制力值維持在50 g。術(shù)后3 d給予軟質(zhì)食物（如面包），之后恢復(fù)常規(guī)飲食。每天觀察大鼠體征，檢測拉簧固定狀況，并清潔矯治裝置，若拉簧損壞脫落，及時修復(fù)。分別于加力0 d（空白對照組）、3 d、7 d、14 d后處死大鼠。

1.3 牙齒移動距離測定

在體視顯微鏡下，使用電子游標(biāo)卡尺測量加力前TM組和PAOO+TM組大鼠上頜第一磨牙與上切牙之間的距離。處死大鼠后，去除矯治裝置，取其上頜骨標(biāo)本，再次測量大鼠上頜第一磨牙與上切牙之間的距離。取2次測量數(shù)值之差，為第一磨牙近中移動的距離。每只大鼠測量3次，取平均值。

1.4 HE標(biāo)本的制備

取大鼠上頜骨組織塊，4%多聚甲醛固定48 h，4℃下10%EDTA脫鈣3個月，乙醇脫水，透明，浸漬，石蠟包埋。制備第一磨牙近遠(yuǎn)中方向的縱向切片，厚度為5 μm，49 ℃展片，多賴氨酸包被的玻片撈片，60℃烤片2～3 h，行HE染色。

1.5 RT-PCR檢測

1.5.1 提取總RNA：分別于加力0、3、7、14 d處死大鼠，去除矯正裝置，拔除上頜第一恒磨牙，取其周圍牙槽骨，仔細(xì)去除牙槽骨表面軟組織，放入冷凍管中，置于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｓ肨rizol試劑提取總RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度計測量RNA純度及濃度，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 合成cDNA：用HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒將加力0、3、7、14 d 骨組織提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用miScript Reverse Transcription Kit 試劑盒將加力7 d獲取的骨組織mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5.3 定量RT-PCR：將樣品和引物按照說明書在QuantiFast?SYBR?Green PCR Master Mix中混合。以U6為內(nèi)參基因進行實時定量PCR，對microRNA-30d進行相對定量，95 ℃ 5 min后，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。引物為上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司設(shè)計，上海杰瑞生物工程有限公司合成。microRNA引物采用采用加PolyA尾合成，引物序列見表1。分析擴增完畢后的熔解曲線和擴增曲線，采用2-△△Ct法進行mRNA相對定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。每組實驗重復(fù)3次，取，對正態(tài)分布數(shù)據(jù)進行t檢驗，對非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進行Wilcoxon秩和檢驗，雙側(cè)P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 成功建立大鼠正畸牙齒移動模型

所有大鼠均耐受實驗過程，成功安裝加力裝置，未見正畸拉簧脫落現(xiàn)象。第一磨牙有松動現(xiàn)象，上頜第一及第二磨牙之間存在食物殘渣。

2.2 大鼠正畸牙齒移動距離變化

體視顯微鏡下測量上頜第一磨牙近中移動的距離，空白對照組上頜第一、第二磨牙緊密排列無間隙，加力3 d后有間隙。隨著時間的增加，TM組、TM+PAOO組牙齒的移動距離不斷加大，TM+PAOO組的移動速度大于TM組，在7 d時移動速率差值最大。見圖1。

圖1 TM組、TM+PAOO組加力后牙齒移動距離Fig.1 The tooth movement distance of TM and TM+PAOO groups

2.3 HE染色結(jié)果

TM組牙周膜結(jié)構(gòu)較致密，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，纖維排列有序，牙周膜寬度均勻，成纖維細(xì)胞也均勻分布于牙周膜纖維之間。PAOO+TM組牙周膜寬度隨加力時間延長而增大，在牙齒移動的第7天最為顯著，牙周膜纖維被拉長，細(xì)胞成分增多，牙槽骨邊緣可見新生血管，牙槽骨和牙骨質(zhì)表面可見活躍的成骨細(xì)胞和新骨沉積，見圖2。

2.4 相關(guān)成骨因子的表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果顯示，加載正畸力后，與空白對照組相比，TM組、PAOO+TM組Runx2及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表達(dá)量逐漸增加，第7天達(dá)峰值。第3、14天時，PAOO+TM組Runx2及ALP的表達(dá)水平高于TM組，而第7天時則低于TM組。見圖3。

為了檢測microRNA-30d是否在加速正畸牙齒移動中產(chǎn)生作用，通過qRT-PCR檢測了加力7 d 后microRNA-30d在PAOO+TM組和TM組的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PAOO+TM組microRNA-30d表達(dá)量是TM組的1.681 8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

3 討論

正畸牙齒移動現(xiàn)象是由骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞與正畸力的耦合反應(yīng)引起的［5］。牙齒移動速度主要取決于根部周圍組織的重塑，而這又受到調(diào)節(jié)牙槽骨和牙周韌帶中細(xì)胞行為的分子的調(diào)控［6］。Runx2作為骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，能特異性結(jié)合許多成骨基因啟動子上的順式作用元件，調(diào)控成骨細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與基因表達(dá)，影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化，參與骨形成和吸收過程［7］。微小RNA是一類非編碼的小RNA分子，由22～25個核苷酸組成，通過與靶mRNA的3’UTR互補或部分互補結(jié)合，使其降解或抑制翻譯，進而調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)水平。近年來，越來越多的研究［8］報道微小RNA通過調(diào)控成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程參與骨重構(gòu)。本課題組之前的研究［9］表明，microRNA-30d參與成骨有關(guān)的生物功能和信號傳導(dǎo)途徑，在成骨細(xì)胞分化的過程中，microRNA-30d低表達(dá)，上調(diào)microRNA-30d能夠抑制Runx2活性，降低ALP活性，抑制骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化。

SD大鼠為嚙齒類動物，切牙較大，屬不斷生長的牙齒，磨牙為多根牙，結(jié)構(gòu)和特性類似于人類牙齒，同時，磨牙的牙槽窩內(nèi)骨更新率高，骨形成和骨吸收能夠達(dá)到很好的平衡，受到外界刺激后牙槽骨的改建也非常明顯且迅速［10］。大鼠牙齒移動模型裝置脫落率較低，以拉簧作為加力裝置，力值穩(wěn)定，衰減較慢，各項力學(xué)性能都較好。據(jù)文獻［11］報道，50 g的正畸力作用于大鼠第一磨牙，牙周組織改建最為明顯。

圖2 不同加力時間大鼠第一磨牙近中移動牙槽骨HE染色 ×200Fig.2 HE staining of alveolar bone around maxillary first molar of rats ×200

圖3 qRT-PCR檢測加力3、7、14 dTM組、PAOO＋TM組牙槽骨組織Runx2、ALP的相對表達(dá)量Fig.3 The relative expression levels of Runx2 and ALP mRNA in TM group and PAOO +TM group on the 3rd，7th and 14th day

目前普遍認(rèn)為正畸牙齒移動是機械力作用于牙周韌帶后產(chǎn)生牙周組織改建的生物力學(xué)現(xiàn)象，這種復(fù)雜的過程既與合成代謝和分解代謝時牙周韌帶和牙槽骨細(xì)胞（破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞）活動水平相關(guān)［12］，還與各種信號通路、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子等變化有密切的關(guān)系，這些細(xì)胞和分子在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平的嚴(yán)格調(diào)控可影響牙齒移動的速度。破骨細(xì)胞激活是正畸牙齒移動中的第一步和限速步驟。然而，破骨細(xì)胞不能單獨發(fā)揮作用，需要來自成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的信號，以促使其成熟、活化及靶向特異性骨吸收。成骨相關(guān)因子在加速正畸牙齒移動過程中也會起到一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA在成骨和破骨信號傳遞過程中起重要作用。microRNA-30d 屬于miR-30家族成員之一，位于人類染色體8q24.22。研究［13-14］發(fā)現(xiàn)miR-30家族的成員在心臟細(xì)胞中高度表達(dá)，與肺及乳腺腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞的衰老等密切相關(guān)。miR-30家族綁定在Runx2mRNA的3’末端翻譯區(qū)，通過靶向Runx2負(fù)調(diào)節(jié)BMP-2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化［15］。PENG 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-30家族通過靶向Smad1和Runx2負(fù)調(diào)節(jié)成骨分化。同時，轉(zhuǎn)化生長因子-β可以通過BMP/Smad信號通路募集組蛋白去乙酰化酶下調(diào)micro-RNA-30d的表達(dá)［17］。

Runx2是骨組織生長發(fā)育過程中非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，Runx2與成骨細(xì)胞異性順式作用元件結(jié)合后，激活骨鈣素、骨橋蛋白、骨涎蛋白和Ⅰ型膠原基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，還可以誘導(dǎo)骨保護素與Runx2結(jié)合，減少破骨細(xì)胞的產(chǎn)生［18］。Runx2表達(dá)受維生素D3、TGF-β/BMP-2、Wnt等多條信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控。同時，BMP/Smad信號通路對Runx2的表達(dá)也會產(chǎn)生影響，已經(jīng)證實Runx2為Smad信號途徑下游的效應(yīng)分子，BMP的抑制和缺陷可以顯著下調(diào)Runx2的表達(dá)。Runx2可以與Smad1和Smad5相互作用，增強成骨特異性基因的表達(dá)［19］。此外，微小RNA也可以控制Runx2的成骨活性并影響成骨細(xì)胞的成熟［20］。

本研究中，PAOO+TM組和TM組的Runx2和ALP的表達(dá)水平在加力3 d和7 d后逐漸增加，于7 d達(dá)到峰值，隨后逐漸降低。7 d 時，PAOO+TM組Runx2和ALP的表達(dá)量低于TM組，PAOO+TM組microRNA-30d的表達(dá)量明顯高于TM組。因此，推測PAOO加速正畸牙齒移動可能是通過抑制成骨合成代謝過程，將移動牙區(qū)域的骨密度維持在相對較低的水平，進而加速正畸牙齒移動。