肝癌高表達(dá)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肝癌中的表達(dá)及其對(duì)自噬水平的影響

崔大煒，邢育柏，金宏遠(yuǎn)，彭雪強(qiáng)，楊良，范慶

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬（珠海）醫(yī)院普通外科，廣東 珠海 519100；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普通外科，沈陽(yáng) 110032）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年約有43.7萬(wàn)人被確診為HCC，其中約50%發(fā)生在中國(guó)［1-2］。盡管隨著外科手術(shù)方法和介入、消融等技術(shù)的不斷進(jìn)步，HCC的治療效果得到改善，但患者5年生存率僅約26%［3］。研究肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制，有助于探尋肝癌的早期診斷與靶向治療的新靶點(diǎn)。自噬是細(xì)胞通過(guò)溶酶體或液泡分解自身組分，以達(dá)到維持細(xì)胞內(nèi)正常生理活動(dòng)和穩(wěn)態(tài)的一種細(xì)胞代謝過(guò)程［4］。自噬在真核生物中保守存在，與人類疾病和健康息息相關(guān)，其中在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中能夠通過(guò)降解細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等為腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需［5］。通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞的自噬水平從而治療腫瘤，已經(jīng)成為攻克腫瘤的新思路。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是細(xì)胞中一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA分子，其本身并不具備編碼蛋白的功能［6］。起初認(rèn)為其無(wú)任何編碼功能，但近年來(lái)研究［7-8］顯示lncRNA參與了多種生物學(xué)過(guò)程，尤其是腫瘤的發(fā)病機(jī)制。人們發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA在惡性腫瘤中都有差異性表達(dá)，并且lncRNA在這些惡性腫瘤中充當(dāng)致癌基因或抑癌基因［9］。肝癌高表達(dá)（highly upregulated in liver cancer，HULC）的lncRNA是第一個(gè)在HCC中鑒定出的高表達(dá)的lncRNA，可通過(guò)調(diào)節(jié)鄰近的蛋白質(zhì)編碼基因來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，這意味著HULC在腫瘤細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色［10］。本研究通過(guò)檢測(cè)lncRNA HULC在人肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)情況和體外實(shí)驗(yàn)，探討其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及自噬水平的影響，為臨床肝癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2016年3月至2018年6月間遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬（珠海）醫(yī)院肝癌手術(shù)切除的60例HCC標(biāo)本。60例HCC新鮮冰凍組織標(biāo)本，置液氮冷卻后送-80 ℃冰箱保存。所有組織經(jīng)2名病理醫(yī)師評(píng)估，確診為肝癌組織且復(fù)查無(wú)誤。本研究在醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者簽署知情同意書后進(jìn)行。

1.2 細(xì)胞系和培養(yǎng)條件

肝癌細(xì)胞系（HepG2、Bel-7402、SMMC-7721及Huh7）和Chang Liver細(xì)胞系均購(gòu)自中喬新舟生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)選用高糖DMEM，添加10%胎牛血清，另加雙抗（100 μg/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素）的培養(yǎng)基，置于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每天更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 RNA提取與實(shí)時(shí)PCR

采用TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）裂解細(xì)胞，以用于細(xì)胞內(nèi)總RNA的提取。使用Power SYBR Green（日本TaKaRa公司）做實(shí)時(shí)PCR分析。結(jié)果用GAPDH的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化。HULC上游引物：5’-TCATGATGGAATTG-GAGCCTT-3’，下游引物：5’-CTCTTCCTG-GCTTGCAGATTG-3’；GAPDH上游引物：5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’，下游引物5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’。實(shí)時(shí)PCR和數(shù)據(jù)收集基于ABI 7500平臺(tái)。HULC相對(duì)于GAPDH的表達(dá)采用2-ΔΔCt法計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HULC過(guò)表達(dá)質(zhì)粒為上海吉瑪公司合成、鑒定后提供的商用產(chǎn)品（NR_002766.2），為HULC序列亞克隆至pcDNA3.1載體后構(gòu)建成的質(zhì)粒，pcDNA3.1空白載體作為陰性對(duì)照。將肝癌細(xì)胞株Bel-7402和HepG2按5×105/孔種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，用pcDNA3.1-HULC以及相應(yīng)的陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒）通過(guò)Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后更換培養(yǎng)基，48 h后收獲細(xì)胞用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，72 h后用于Western blotting檢測(cè)。

1.5 CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)具體步驟按照制造商的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。每隔24 h，采用CCK-8試劑（日本同仁化學(xué)研究所）檢測(cè)1次細(xì)胞增殖。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種在96孔板（1×104/孔），加入CCK-8溶液并孵育3 h。然后通過(guò)分光光度法測(cè)量每種溶液在490 nm下的吸光度值。設(shè)置空白對(duì)照組，同時(shí)每組分別設(shè)置4個(gè)復(fù)孔取平均值。

1.6 免疫熒光檢測(cè)LC3

將爬片放入12孔板中，膠原蛋白包被爬片，紫外線燈照30 min。分別將HepG2和Bel-7402細(xì)胞接種于12孔板中，1～2 d換液1次，待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)到65%左右，將pcDNA3.1-HULC質(zhì)粒加入培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，PBS清洗3次，每次5 min。隨后用多聚甲醛固定20 min，再用PBS清洗3遍，每次5 min。Triton透膜，牛血清白蛋白封閉，孵育一抗和二抗，DAPI染核。分別以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的HepG2和Bel-7402細(xì)胞為對(duì)照組，在熒光顯微鏡下檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞內(nèi)LC3熒光斑點(diǎn)的數(shù)量與分布。

1.7 Western blotting

對(duì)細(xì)胞用裂解液進(jìn)行蛋白提取，然后使用SDSPAGE等試劑，將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜（美國(guó)Sigma公司）上，用特定抗體孵育，進(jìn)而檢測(cè)特定蛋白（LC3抗體、Atg3和β-actin購(gòu)自美國(guó)ProteinTech公司）的表達(dá)。通過(guò)放射密度測(cè)定法（Quantity One軟件，美國(guó)Bio-Rad公司）對(duì)放射自顯影圖片進(jìn)行量化。將β-actin作為對(duì)照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。定量資料用表示，采用Studentt檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HULC在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)水平

采用實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)60例肝癌患者樣本中HULC的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，肝癌組織中 HULC 的表達(dá)水平顯著高于相鄰正常肝組織（P＜ 0.05）（圖1A）。檢測(cè)HULC在人肝癌細(xì)胞系HepG2、Bel-7402、SMMC-7721及Huh7中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述4種肝癌細(xì)胞系中HULC的表達(dá)水平均高于正常肝細(xì)胞系Chang Liver（P＜ 0.05）（圖1B）。由于HULC在HepG2和Bel-7402中的表達(dá)相對(duì)較低，因此用于后續(xù)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1過(guò)表達(dá)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中。

2.2 過(guò)表達(dá)HULC促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖

圖1 HULC在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)情況Fig.1 Expression levels of HULC in HCC tissues and normal tissues

首先，在肝癌細(xì)胞HepG2和Bel-7402中成功轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HULC質(zhì)粒。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證pcDNA3.1-HULC轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，pcDNA3.1-HULC的轉(zhuǎn)染效率分別為23倍與31倍（圖2A）。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)HULC過(guò)表達(dá)細(xì)胞系增殖能力的變化，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HULC后肝癌細(xì)胞系增殖能力顯著增加（圖2B）。

2.3 過(guò)表達(dá)HULC表達(dá)能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞自噬水平

為了探討HULC對(duì)肝癌細(xì)胞自噬水平的影響，在轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-HULC質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞系HepG2、Bel-7402中，通過(guò)Western blotting檢測(cè)過(guò)表達(dá)HULC的肝癌細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3表達(dá)情況。結(jié)果顯示，當(dāng)HepG2和Bel-7402細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HULC后，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化增多（圖3A）。這表明HULC能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬。為了判斷HULC對(duì)自噬體形成的影響，采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察LC3熒光斑點(diǎn)的形成情況。結(jié)果顯示，當(dāng)肝癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)HULC時(shí)，LC3熒光斑點(diǎn)形成增加（圖3B）。以上結(jié)果表明，HULC能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬水平。

2.4 過(guò)表達(dá)HULC促進(jìn)肝癌細(xì)胞中Atg3表達(dá)

為了明確HULC促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬的機(jī)制，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HULC質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞系HepG2、Bel-7402中，采用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Atg3的表達(dá)。結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)HULC的肝癌細(xì)胞中Atg3表達(dá)顯著上調(diào)（圖4A）。這表明HULC可以促進(jìn)Atg3的表達(dá)。

3 討論

lncRNA HULC是在肝癌中特異性高表達(dá)的lncRNA。由HULC基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)，該基因定位在6p24.3，全長(zhǎng)500 nt，含2個(gè)外顯子（長(zhǎng)度分別為303和182 bp）和1個(gè)內(nèi)含子（長(zhǎng)度為1 152 bp）。HULC基因轉(zhuǎn)錄后，產(chǎn)物經(jīng)剪切、加工后形成長(zhǎng)度為500 bp的RNA，與mRNA結(jié)構(gòu)類似，具有且poly A尾結(jié)構(gòu)。由于含有多個(gè)終止密碼子，無(wú)編碼蛋白功能，lncRNA HULC的保守性差導(dǎo)致其基因的多態(tài)性，與腫瘤易感性相關(guān)［11］。lncRNA HULC在肝癌組織中特異性高表達(dá)可能與肝癌微環(huán)境有關(guān)。近年來(lái)的研究［12-13］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些異常表達(dá)的lncRNA對(duì)不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有潛在作用，參與調(diào)控細(xì)胞免疫、凋亡、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。另外研究［14］發(fā)現(xiàn)，lncRNA能夠通過(guò)表觀遺傳的調(diào)控方式影響腫瘤的生長(zhǎng)。目前為止，人們對(duì)lncRNA的了解仍處于不斷探索的階段。

圖2 HULC對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和Bel-7402增殖的影響Fig.2 Effect of pcDNA3.1-HULC on the proliferation of HepG2 and Bel-7402 cells

圖3 HULC對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和Bel-7402自噬的影響Fig.3 Effect of HULC on autophagy in HepG2 and Bel-7402 cells

圖4 HULC上調(diào)促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2和Bel-7402中Atg3表達(dá)Fig.4 Overexpression of HULC upregulated the expression of Atg3 protein in HepG2 and Bel-7402 cells

研究［15］表明，自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯(lián)系。自噬可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系來(lái)促進(jìn)腫瘤的存活與增殖。因此，通過(guò)促進(jìn)或者抑制自噬從而治療腫瘤，已經(jīng)成為攻克腫瘤的新思路。隨著人們對(duì)lncRNA的認(rèn)識(shí)加深，其在自噬中的作用也逐漸受到人們的關(guān)注，一些lncRNA可以抑制自噬的發(fā)生，如Risa、H19等［16］；與之相反，有些lncRNA能夠促進(jìn)自噬的發(fā)生，如BANCER、NEAT2、PTENT1、HOTAIR等［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)，HULC在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肝組織，并且在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)也高于正常肝細(xì)胞系。通過(guò)成功構(gòu)建HULC過(guò)表達(dá)的HepG2和 Bel-7402細(xì)胞系，本研究首先檢測(cè)了肝癌細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)HULC的肝癌細(xì)胞系中細(xì)胞增殖能力顯著增加。同時(shí)在自噬水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)HULC能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬的發(fā)生。而且本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HULC能夠顯著誘導(dǎo)Atg3的上調(diào)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，HULC在肝癌的發(fā)展過(guò)程中扮演著促癌基因的角色，能夠促進(jìn)自噬的發(fā)生，進(jìn)而為腫瘤生存提供物質(zhì)與能量基礎(chǔ)。本研究結(jié)果可能為肝癌的靶向治療提供新的方向，但具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。