bFGF基因與體外轉染缺血性心肌病患者骨髓基質干細胞的相關性

劉效波 荊麗杰 劉寶堂 侯文明 李 磊 趙 進 李子軍

（濰坊醫學院附屬醫院心血管外科，山東 濰坊 261031）

缺血性心肌病是由冠狀動脈粥樣硬化引起的心肌長期缺血，導致心肌彌漫性纖維化。臨床常表現為，心力衰竭和心絞痛[1-2]。骨髓基質干細胞是一種具有多向分化潛能的細胞總稱，存在于骨髓中，能夠向多種細胞進行分化，在體外能迅速擴增，廣泛的來源，是目前修復各種病癥的理想型種子細胞。但在成體動物中僅占有核細胞的十萬分之一，在骨髓中也僅僅只占0.25%，含量相對較低，難以廣泛應用，在過往的基因治療研究當中將它作為靶細胞的研究很少[3-4]。本次實驗通過bFGF基因體外轉染缺血性心肌病患者骨髓基質干細胞的研究，觀察標記和檢測轉染對骨髓基質干細胞的生長增殖所帶來的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2010年～2018年我院收治的缺血性心肌病患者48例，其中男性患者23例，女性患者25例，年齡為41～72歲，平均年齡為（54.8±6.9）歲，患缺血性心肌病病程時間平均為3.6年。將所有患者按照隨機表法分為觀察組和對照組兩組，每組24例，其中觀察組患者11例，女性患者13例，年齡為45～71歲，平均年齡為（61.8±8.6）歲，患缺血性心肌病病程時間平均為3.4年。對照組患者15例，女性患者9例，年齡為46～68歲，平均年齡為（52.2±7.9）歲，兩組患者性別、年齡以及患缺血性心肌病病程等均無明顯差異，實驗結果具有可參考性。

1.2 納入和排除標準。納入標準：①所有患者均符合《2011歐洲心臟病學會非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征處理指南》[5]標準，診斷為缺血性心肌病。②所有患者均經冠狀動脈造影檢查，具有明確心肌缺血癥狀[6-7]。③臨床資料完整，經我院倫理委員會批準，所有患者自愿加入本次實驗。排除標準：①先天性心臟病、貧血性心臟病以及其他類型的心臟疾病。②肝臟、腎臟等重要功能不全者。③惡性腫瘤患者。④資料不全，配合度不佳的患者。

1.3 治療方法：征得患者同意的情況下，在進行心外科手術開胸的同時，從患者胸骨骨髓抽取骨髓基質干細胞，4～6 mL，放置于肝素和含有15 mL的100%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素鈉的α-MEM混合溶液中，保持37 ℃溫度、飽和濕度和5%的二氧化碳中接種于培養皿中，觀察顯微鏡下細胞分裂和增殖情況。16～18 d 80%細胞核出現融合時傳代，細胞活性通過臺盼藍試劑進行拒染實驗，繪制細胞生長曲線。再取2代細胞，采用Lipofectamine轉染試劑將重組真核表達質粒pIRFS2-EGFP-bFGF來轉染缺血性心肌病患者的骨髓基質干細胞。

1.4 觀察指標：①倒置熒光顯微鏡觀察：在對于骨髓基質干細胞進行轉基因后，觀察顯微鏡下4、12、24、48、72 h以及傳代后24 h的標志基因熒光蛋白（EGFP）強度表達情況。②轉染效率計算：轉染效率=EGFP陽性細胞數/總細胞數×100%。③bFGF濃度測定：采用酶聯免疫吸附法（ELISE）檢測轉染后4、12、24、48、72 h培養的上層清液濃度。④細胞爬片免疫組化染色：對48 h后的細胞爬片進行轉染，丙酮固定bFGF免疫組化染色，觀察是否出現蛋白質水平的bFGF表達，采用488 nm波長激發。

1.5 統計學處理：對于本次實驗研究的數據采用SPSS 19.0 軟件進行統計分析處理，計量資料采用均數±標準差（±s）來表示，對照組和觀察組之間的比較采用t檢驗；計數資料率的比較采用χ2檢驗。其中P＜0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者轉基因效率對比：見表1。觀察兩組患者在pIRFS2-EGFPbFGF轉染后的熒光顯微鏡下標志基因EGFP陽性細胞數量和總數的情況，發現最初的標記基因熒光強度最強，從4～48 hEGFP陽性細胞數量逐漸增多，轉基因效率逐漸升高，而在48～72 h內強度逐漸減弱，轉基因效率反而有所下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 兩組患者轉基因效率對比（%，±s）

表1 兩組患者轉基因效率對比（%，±s）

2.2 兩組患者bFGF濃度變化情況：見表2。采用酶聯免疫吸附法（ELISE）檢測轉染后4、12、24、48 h的bFGF濃度逐漸升高到23.5 ng/mL，而在48～72 h內濃度慢慢降低。差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 兩組患者bFGF濃度變化情況（ng/mL）

3 討 論

本次實驗發現，采用Lipofectamine轉染試劑將重組真核表達質粒pIRFS2-EGFP-bFGF來轉染缺血性心肌病患者的骨髓基質干細胞，可以在一定時間內分泌出相對較高水平的bFGF蛋白質，從而有效的促進細胞的分裂和增值，發揮生長因子的活性和生理作用，修復缺血的心肌組織，未來可以考慮作為缺血性心肌病患者的心肌基因治療靶細胞[9-12]。