用于毛細管二維液相色譜的微納樣品轉移技術

劉婭　張博

摘 要 親水相互作用色譜（HILIC）與反相色譜（RPLC）是目前常用的二維液相色譜分離模式，但兩種色譜模式存在流動相不兼容的問題， 因而對二維液相色譜聯用過程中的樣品轉移技術提出了較高的要求。 本研究建立了一種可用于HILIC-RPLC二維液相色譜的樣品轉移技術，通過溶劑補充稀釋和捕集柱富集的方法解決了二維液相色譜聯用過程中溶劑不兼容的問題。通過對補充液的流速進行優化，可將第一維HILIC分離的有機相比例降至5%以下，實現高達95%的樣品轉移效率。將此技術應用于蛋白質酶解物的二維色譜分離，理論峰容量可達680，而且峰容量可隨第一維采樣頻率的增加而增大，表明此技術可用于復雜樣品的高分辨分離分析。

關鍵詞 二維液相色譜; 親水相互作用色譜; 反相色譜; 樣品轉移; 峰容量

1 引 言

二維分離技術是解決復雜體系分離與分析最有前景的手段之一，可有效提高色譜分離的選擇性和峰容量[1]。二維分離的概念最早由Giddings提出[2]，該方法通過耦聯兩種不同的色譜分離模式，實現復雜樣品的充分分離。二維色譜的理論峰容量是兩個維度色譜分離峰容量的乘積[3]，可分為在線和離線聯用兩種模式[4]。為了有效增加二維液相色譜分離的分辨率，要求兩個維度的色譜分離具有較高的正交性[5]。親水相互作用色譜（Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）與反相色譜（Reversed phase liquid chromatography，RPLC）正交性良好，是目前最常使用的二維液相色譜分離模式組合之一。但HILIC與RPLC聯用時存在溶劑不兼容的問題[6]：HILIC使用的高有機流動相在RPLC中顯現出高洗脫強度，而反相色譜使用的高水流動相也是HILIC模式的強洗脫液。因此，第一維分離使用的流動相總在第二維分離中顯現出高洗脫強度，可能導致第一維分離得到的樣品在轉入第二維分離時難以保留，導致第二維分離的分辨率降低，所以對兩種色譜模式的聯用方式提出了較高的要求。

目前，常用的HILIC與RPLC二維液相色譜聯用方式有離線聯用[7～10]、第一維使用細內徑色譜柱[11～14]、溶劑蒸發[15]和溶劑補充稀釋[16～19]等。其中，離線聯用是最常用的聯用方式，其將第一維分離出來的樣品分段接出，經干燥復溶后，再轉入第二維進行分離。該方法具有較大的靈活度，可分別對兩個維度的分離進行獨立優化，從而有效提高整體的分離性能。但離線聯用耗時耗力，并且轉移過程中可能會有樣品損失，所以僅適用于大體積樣品的轉移，較難進行微量樣品的處理和轉移。也有研究者嘗試采用細的第一維色譜柱和粗的第二維色譜柱，以解決溶劑不兼容的問題。但這種方法的局限性在于：第一維色譜柱內徑細，樣品容量低;第二維分離過程中樣品的度稀釋高，會大大降低檢測靈敏度，且與質譜聯用也較不友好。Tian等[15]開發了一種結合真空蒸發的二維液相色譜系統。第一維色譜柱分離出來的樣品存儲在定量環中，并通過真空干燥使樣品黏附在定量環內部，之后樣品溶解在第二維色譜柱使用的流動相中，再進行第二維分離。通過這種方法可有效解決溶劑不兼容的問題，但仍存在樣品易丟失和儀器裝置復雜等缺點，所以并未得到廣泛應用。通過溶劑補充稀釋將第一維色譜柱分離使用的流動相轉化為與第二維色譜柱分離兼容的流動相，也是一種較常用的方法。通常，在第一維色譜柱分離的出液端通過三通引入與第二維分離兼容的溶劑進行稀釋，再通過捕集柱預濃縮樣品，之后將捕集柱與第二維色譜柱耦聯后進行第二維分離。采用這種方法可大大降低第一維流動相的影響，也不會降低檢測靈敏度。但這種方法也存在一些問題，當僅使用一根捕集柱通過反復切閥進行樣品捕集和分離時[16]，第一維色譜柱分離會出現停流的現象，會造成樣品返混的現象，且耗時也較長。當使用兩根捕集柱進行交替捕集和分離時[17～19]，第二維色譜柱分離需使用短柱進行快速分離，無法達到分離性能最大化。此外，目前大部分二維液相色譜分離方法都是基于常規色譜柱或細徑柱進行的，基于毛細管色譜柱的二維液相色譜研究仍然較為有限，因而發展面向二維液相色譜的微納樣品轉移技術具有重要的意義。

本研究采用單顆粒柱塞技術[20]制備HILIC、RPLC毛細管液相色譜柱和捕集柱，通過與十通道流路選擇閥進行耦聯，實現二維液相色譜的微納樣品轉移。此技術結合了離線聯用和溶劑補充稀釋，實現了微量樣品的高效轉移，且可對兩個維度的色譜分離進行獨立優化，實現分離效能的最大化。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

P230高壓恒流泵（大連依利特儀器有限公司）; TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）; Ultimate 3000納流液相色譜儀（荷蘭Thermo-Dionex公司）; 488 nm激光誘導熒光檢測器（美國Beckman Coulter公司）; 超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）; 光學顯微鏡（福建麥克奧迪實業集團有限公司）; Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）。

色譜純甲醇、色譜純乙腈（ACN）、色譜純三氟乙酸（TFA）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、胰蛋白酶、細胞色素C、牛血清白蛋白、轉鐵蛋白、a-酪蛋白和肌紅蛋白（美國Sigma-Aldrich公司）; 熒光標記試劑NBD-F（日本TCI公司）; 二氧六環、尿素和碳酸氫銨（分析純， 國藥集團化學試劑有限公司）。

熔融石英毛細管（河北永年銳灃色譜器件有限公司）; 單顆粒柱塞（廈門宜柱科技有限公司）; 毛細管切割器（日本GL Sciences公司）; TFE套管、FEP套管、PEEK套管、接頭、二通、三通（美國IDEX Health & Science公司）; 10通道流路選擇閥（美國Valco instrument公司）; 3 μm TSKgel Amide-80填料（日本TOSOH公司）; 5 μm Ultimate XB-C18填料（上海月旭材料科技有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 毛細管液相色譜柱的制備 HILIC、RPLC毛細管填充柱和毛細管捕集柱的制備采用單顆粒柱塞技術[20]，具體步驟如下：（1）將單顆粒柱塞填入毛細管的一端作為出口塞; （2）通過高壓泵將勻漿液壓入帶柱塞的毛細管內部，填柱壓力最高達40 MPa; （3）當柱床達到需要的長度后緩慢泄壓，再填入入口塞。用這種方法制備了長20 cm、內徑100 μm的HILIC色譜柱，長15 cm、內徑100 μm的RPLC色譜柱和100 μm內徑的毛細管捕集柱（柱床長1 cm，全長7 cm）。

2.2.2 樣品的制備 分別制備了5種標準蛋白質酶解物樣品：稱取1 mg蛋白質樣品，溶解于50 mL 40 mmol/L pH 8.0碳酸鹽緩沖溶液，如果蛋白質分子量較大（如牛血清白蛋白和轉鐵蛋白），需要使用8 mol/L尿素使蛋白質變性。再向蛋白質溶液加入16 μL 50 mmol/L DTT溶液，56℃水浴45 min，以打開蛋白質中的二硫鍵。待蛋白質溶液冷卻到室溫后，加入54 mL 55 mmol/L IAA溶液，避光放置30 min，以防止游離的巰基再次生成二硫鍵。之后加入適量的胰蛋白酶溶液（酶與蛋白質的質量比約為1∶50）于37℃反應2 h，再加入等量的酶溶液于37℃反應18 h。酶解溶液冷卻到室溫后，加入10 μL 10%甲酸溶液終止反應，離心，取上清液。

對蛋白質酶解物樣品進行熒光標記：在20 μL蛋白質降解物樣品中加入200 μL硼砂緩沖液（pH 8.0），再加入40 μL 1 mg/mL NBD-F溶液，混勻后在60℃下避光反應30 min，最后加入480 μL 50 mmol/L HCl溶液。

對用于HILIC分離的樣品需溶解在高濃度ACN溶液中，所以蛋白質樣品需要凍干后復溶到90% ACN溶液中，樣品濃度為1 mg/mL。

2.2.3 色譜分離條件 在Ultiamte 3000納流液相色譜系統上分別進行HILIC和RPLC一維液相色譜分離和二維液相色譜分離。 流動相A： 0.1% TFA，流動相B： ACN + 0.1% TFA。

對于HILIC一維色譜的分離， 流速： 350 nL/min; 樣品： 細胞色素C降解物; 進樣體積： 0.2 μL; 梯度洗脫： 0～5 min， 97% B; 5～35 min， 97%～65% B; 36～46 min， 60% B; 47～57 min， 97% B。對于RPLC一維色譜分離， 流速： 350 nL/min; 樣品： 細胞色素C降解物; 進樣體積： 0.2 mL; 梯度洗脫： 0～5 min， 5% B; 5～35 min， 5%～50% B; 36～46 min， 80% B; 47～57 min， 5% B。

對于HILIC-RPLC二維液相色譜分離， 第一維采用長20 cm的HILIC毛細管色譜柱進行分離， 流速： 200 nL/min; 樣品： 5種標準蛋白質酶解物; 進樣體積為1 μL; 第一維分離的梯度洗脫程序： 0～5 min， 97% B; 5～35 min， 97%～65% B; 36～50 min， 60% B; 51～70 min， 97% B。第一維分離得到的樣品通過100%的水相溶劑進行補充稀釋， 再分段捕集到不同的C18捕集柱上， 之后捕集柱與第二維色譜柱連接即可進行第二維分離。第二維采用15 cm長的RPLC毛細管色譜柱進行分離， 流速： 350 nL/min; 梯度洗脫程序： 0～5 min， 5% B; 5～35 min， 5%～50% B; 36～46 min， 80% B; 47～57 min， 5% B。

3 結果與討論

3.1 面向二維液相色譜的微納樣品轉移技術

在傳統的HILIC-RPLC二維液相色譜分離方法中，第一維分離產生的餾分直接轉入第二維色譜柱，嚴重的稀釋效應和流動相不兼容的問題會直接影響色譜分離的分辨率和峰容量[21]，限制了HILIC-RPLC二維液相色譜的應用。在本研究中，為了解決HILIC與RPLC二維分離過程中溶劑不兼容的問題，設計了一種帶有捕集柱和補充液的新型樣品轉移系統。此系統可避免稀釋效應引起的靈敏度降低，實現微量樣品的高效轉移，而且兩個維度的色譜柱都可以在最佳分離條件下運行。

采用C18捕集柱作為二維液相色譜聯用過程中轉移樣品的容器，通過HILIC毛細管色譜柱、三通、十通道流路選擇閥和捕集柱的連接， 構建面向HILIC-RPLC二維液相色譜的樣品轉移系統，裝置如圖1所示。其中，第一維液相色譜使用HILIC毛細管色譜柱進行分離。對于HILIC分離過程中產生的強洗脫餾分（對于RPLC是強洗脫餾分）， 在HILIC毛細管色譜柱的出液端連接三通，引入弱洗脫溶劑進行稀釋。之后，通過十通道流路選擇閥將稀釋后的樣品組分分段捕集到不同的C18捕集柱上。如將第一維分離得到的樣品切割成10個組分以下，則連接上所需數量的C18捕集柱即可; 如果將第一維分離的樣品切割成10個組分以上，則需將富集到樣品的捕集柱依次替換成新的捕集柱進行實驗。最后，將捕集柱通過二通連接到RPLC毛細管色譜柱上，即可進一步進行第二維反相液相色譜分離。

對于面向HILIC-RPLC二維液相色譜的微納樣品轉移平臺， 影響樣品轉移的效率和二維分離的性能的參數包括第一維和第二維色譜的分離條件、補充液的流速和第一維分離樣品的切割頻率等。對于HILIC和RPLC分離條件的選擇，本研究組之前的工作中已分別對這兩種固定相制備的毛細管色譜柱的性能進行了研究[22，23]，并建立和優化了相應的分離條件。

如圖2所示，在選定的分離條件下， 分別用HILIC和RPLC毛細管色譜柱對細胞色素C酶解物進行一維液相色譜分離，在30 min的梯度洗脫時間內獲得的峰容量分別為45和87。由此可知，兩種色譜模式在進行一維液相色譜分離時獲得的峰容量較為有限，無法用于復雜樣品體系的高分辨分離，也證明了二維液相色譜分離的必要性。

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Microscale Sample Transfer Technology for Capillary

Two-Dimensional Liquid Chromatography

LIU Ya， ZHANG Bo*

（College of Chemistry & Chemical Engineering， Xiamen University， Xiamen 361005， China）

Abstract Hydrophilic interaction chromatography （HILIC） coupled with reverse phase liquid chromatography （RPLC） is the most commonly used two-dimensional separation mode. However， it is suffered from the incompatibility of mobile phase. To overcome this issue， a microscale sample transfer technology was developed for capillary HILIC-RPLC two-dimensional liquid chromatography in this work. The sample transfer technology was consisted of weak elution make-up liquid and trap column， so that the strong elution solvent from the first dimension could be diluted effectively. Through optimization of make-up flow rate， the organic concentration of the first dimension effluent was reduced to less than 5%， and up to 95% sample transfer efficiency was achieved. This technology was applied to the two-dimensional separation of five standard protein digest. When 8 sample fractions from the first dimension separation were transferred to the second dimension separation， a theoretical peak capacity of 680 could be obtained. In addition， the peak capacity could be improved with the increasing sampling frequency， suggesting that this technology could be effectively applied to high-resolution separation of complex mixtures.

Keywords Two dimensional liquid chromatography; Hydrophilic interaction chromatography; Reverse phase chromatography; Sample transfer; Peak capacity