熱處理對酶改性蛋黃液乳化性的影響及拉曼光譜分析

徐 楠，趙 英，遲玉杰*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

液態蛋是指禽蛋打蛋去殼，將蛋液經過攪打、殺菌及包裝等處理后冷藏制成的代替鮮蛋消費的產品。可分為蛋白液、蛋黃液和全蛋液3 類。液態蛋產品不僅克服了鮮蛋易碎、易污染、難運輸和難貯藏等缺點，而且省去了打蛋、分蛋及處理蛋殼等操作，因此在工業生產及家庭生活中受到了廣泛歡迎[1]。液態蛋生產的關鍵技術之一是殺菌技術。由于禽蛋中的蛋白質熱凝固溫度一般在60 ℃左右[2]，經過較高溫度或較長時間熱處理，會導致蛋白質變性，從而引起其功能性質的下降[3-5]。各國采用的蛋黃液殺菌溫度為60～65 ℃，其在4 ℃下的保存期只有20 d左右，極大地制約了蛋黃液的應用。因此，提高蛋黃液在熱處理后的功能性質、開發新型蛋黃液產品十分必要。

酶改性是指利用生物酶制劑在溫和的條件下催化蛋白質水解以達到修飾蛋白質的作用，是一種不減弱食品營養價值、同時能夠獲得更好功能性質的簡便方法。蛋黃中大部分蛋白質為脂蛋白[6]，因此可以利用蛋白酶和磷脂酶對其進行改性。Wang Guang等[7]利用兩種食品級的內切蛋白酶來制取水解度分別為3%和6%的蛋黃蛋白水解物，水解后的蛋黃乳化能力和穩定性得到了較大程度的提高。Bao Zhijie等[8]利用堿性蛋白酶水解蛋黃蛋白質，發現水解度10%時蛋黃蛋白質乳化能力明顯提高。劉劍秋等[9]研究發現使用復合風味蛋白酶部分水解全蛋蛋白可使其熱凝固溫度提高到75 ℃。王迎新等[10]發現經磷脂酶修飾后蛋黃粉的乳化性和熱穩定性均有顯著提高。

盡管國內外均開展了關于酶改性對蛋黃液功能性質影響的研究，但關于酶改性蛋黃液在熱處理后乳化性質變化情況的研究相對較少。采用拉曼光譜對酶改性蛋黃液蛋白質構象變化與功能性質之間構效關系的研究也鮮有報道。本研究采用中性蛋白酶對蛋黃液進行酶改性，探究改性前和酶改性后蛋黃液在不同熱處理條件（60、65、70 ℃均處理4 min）下蛋白結構和功能性質的變化，解析結構變化與功能性質的關系，以期為酶改性技術在液態蛋生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋 哈爾濱市香坊區忠君超市；大豆色拉油哈爾濱九三油脂有限責任公司；中性蛋白酶（酶活力9.8×104U/g） 上海源葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、氯化鈉等均為國產分析純；實驗中所用的水均為超純水。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器 上海浦東物理光學儀器廠；T18高速勻漿機 德國IKA公司；TU-1800紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；2000型激光粒度儀 英國馬爾文公司；inVia顯微拉曼光譜儀 英國雷尼紹公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

蛋黃液制備的具體工藝流程[1]如下。

中性蛋白酶是一種內切酶，廣泛應用于動植物蛋白的酶改性。其最適作用pH值為6.5～7.0，與蛋黃液的pH值基本一致；最適作用溫度為45～55 ℃，略小于蛋黃中蛋白質的變性溫度，能夠保證蛋黃的酶改性在溫和條件下高效進行，故采用中性蛋白酶進行蛋黃液的酶改性。酶改性條件為：中性蛋白酶質量分數0.05%、酶解時間45 min、反應溫度47 ℃。熱處理采用水浴法，溫度分別為60、65 ℃及70 ℃，處理時間均為4 min。裝填包裝后的蛋黃液于4 ℃下貯存備用。

1.3.2 乳化活性和乳化穩定性的測定

參考Comas等[11]的方法并稍作改動。用0.5 mol/L的氯化鈉溶液將蛋黃液稀釋為蛋白質量濃度0.01 g/mL的溶液，取上述溶液20 mL，加10 mL大豆色拉油，室溫下用高速勻漿機10 000 r/min均質1 min以形成乳化液，在不同時間從此乳狀液底部取20 μL，用含1 mg/mL SDS溶液稀釋300 倍體積，以相同質量濃度的SDS溶液作為參比液，在500 nm波長處測定吸光度。乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）、乳化穩定性指數（emulsion stability index，ESI）分別按式（1）、（2）計算。

式中：T＝2.303，為ln 10的近似值；N為稀釋倍數（300）；ρ為乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為乳化液中油相體積分數/%；A0為0 min時的吸光度；A30為30 min時的吸光度。

1.3.3 粒徑大小及分布的測定

參考Campbell等[12]的方法，采用動態光散射技術，利用2000型激光粒度分析儀測定新鮮制備的乳狀液的粒徑大小及其分布，測定溫度25 ℃。參數設置為：顆粒折射率1.520、顆粒吸收率0.001，分散劑為水，分散劑折射率1.330。實驗采用D4,3（體積平均粒徑）表征液滴粒徑的大小[13]。Dν10、Dν50和Dν90分別表示占整個乳化體系10%、50%和90%顆粒的體積平均粒徑。樣品均質后立即測定，每個樣品重復3 次。

1.3.4 拉曼光譜分析

參考Herrero等[14]的方法，將蛋黃液樣品置于載玻片上進行拉曼光譜掃描，激發光波長為532 nm，激光功率為0.075 mW，掃描范圍400～2 000 cm－1，每次掃描時間60 s，積分10 次，3 次掃描進行累加，峰位誤差小于3 cm－1。以苯丙氨酸（1 003±1）cm－1作為歸一化因子[15]，采用WiRE? 2.0軟件得到蛋黃液的拉曼光譜。圖譜基線校正、譜峰歸屬查找采用OMINIC軟件。圖譜擬合采用Origin 8.6軟件。采用Alix等[16]的方法分析各樣品蛋白二級結構的相對含量。

1.3.5 乳化性模型的建立

應用Unscrambler多變量統計分析軟件中的偏最小二乘法（partial least squares，PLS）及主成分回歸方法建立校正模型，并采用完全交互驗證方式得到驗證模型的各項參數。

1.4 數據統計與分析

所得數據均為3 次重復的平均值，利用SPSS 17.0軟件分析數據，P＜0.05為具有顯著性差異。采用Origin Pro 8.6軟件進行數據分析和圖譜處理。

2 結果與分析

2.1 熱處理對酶改性蛋黃液乳化性質的影響

EAI表征蛋白質吸附在油水界面的能力，反映了蛋白質形成并穩定乳狀液的能力；ESI反映了乳化劑維持乳化體系穩定性的能力，因此EAI和ESI是衡量乳化體系乳化性能的重要指標[17-18]。

如圖1所示，與25 ℃相比，隨著熱處理溫度的升高，兩組蛋黃液的EAI均呈現下降的趨勢，60 ℃、4 min熱處理不會引起蛋黃液EAI的顯著下降。當熱處理溫度超過60 ℃后，蛋黃液的EAI顯著下降（P＜0.05）。在經過同等強度的熱處理后，酶改性蛋黃液的EAI均顯著高于未改性蛋黃液（P＜0.05）。這與Guilmineau等[19]的研究結果基本一致。熱處理會導致蛋白質結構的改變，變性程度取決于熱處理的強度。蛋白質變性后聚集，甚至可能形成凝膠[20]。

圖 1 熱處理對酶改性蛋黃液EAI的影響Fig. 1 Effect of heat treatment on ESI of enzymatically modified egg yolk liquid

圖 2 熱處理對酶改性蛋黃液ESI的影響Fig. 2 Effect of heat treatment on ESI of enzymatically modified egg yolk liquid

如圖2所示，與25 ℃相比，隨著熱處理溫度的升高，兩組蛋黃液的ESI均呈現上升的趨勢。60 ℃、4 min熱處理會引起蛋黃液ESI的顯著升高；處理溫度超過65 ℃后，熱處理對蛋黃液ESI的影響不顯著，ESI趨于穩定。在經過同等溫度的熱處理后，酶改性蛋黃液的ESI均顯著高于未改性蛋黃液（P＜0.05）。

2.2 熱處理對酶改性蛋黃液乳化體系粒徑大小和分布的影響

乳化體系中液滴顆粒的粒徑大小和分布反映了形成的乳化體系中乳化劑的乳化活力，會影響乳狀液的物理穩定性和熱穩定性。乳狀液中液滴顆粒越小、分布越均一，則乳狀液體系越趨于穩定[21]。因此，研究蛋黃液乳化體系的粒徑大小及分布對于理解其乳化性質尤為重要。

表 1 不同熱處理條件下酶改性蛋黃液與未改性蛋黃液乳化體系的粒徑大小Table 1 Mean droplet diameter of modified and unmodified egg yolk emulsion systems under different heat treatments

由表1可知，隨著熱處理溫度的升高，乳化體系的平均粒徑表現出增大的趨勢，酶改性蛋黃液形成的乳化體系的平均粒徑（Dν10、Dν50、Dν90）總體上小于未改性蛋黃液。25 ℃未改性蛋黃液的Dν10、Dν50、Dν90分別為10.60、20.53、44.61 μm，經過酶改性后，蛋黃液的Dν10、Dν50、Dν90分別下降至9.13、16.40、34.61 μm（P＜0.05）。與25 ℃時相比，經65 ℃處理后，未改性蛋黃液Dν10、Dν50、Dν90分別上升至12.80、19.97、52.60 μm（P＜0.05），而經相同熱處理的酶改性蛋黃液Dν10、Dν90分別為9.31、34.23 μm，顯著低于未改性蛋黃液（P＜0.05）。乳化體系D4,3的變化趨勢也呈現相同的結果。

圖 3 不同熱處理條件下酶改性蛋黃液與未改性蛋黃液乳化體系的粒徑分布Fig. 3 Particle size distributions of modified and unmodified egg yolk emulsion systems under different heat treatments

如圖3所示，蛋黃液乳化體系體積分布與粒徑大小的變化趨勢一致。隨著熱處理溫度的升高，粒徑峰逐漸正向移動，表現為平均粒徑逐漸增大。改性后蛋黃液所形成的乳化體系粒徑更加接近正態分布，呈現單一峰。而未改性蛋黃液乳化體系粒徑分布更加分散，呈現雙峰，大粒徑顆粒所占比例更大。Hosseini等[22]研究發現乳狀液液滴的粒徑越小，其乳化劑EAI越大，這與本研究結果一致。乳化體系中乳化劑的EAI與粒徑大小及分布呈現負相關。而隨著熱處理溫度的上升，乳化體系ESI升高，粒徑逐漸增大。這可能是由于加熱導致了蛋白質的熱聚集，所以乳化后粒徑有所增加。

2.3 熱處理對酶改性蛋黃液拉曼光譜的影響

表 2 蛋黃液中蛋白質的拉曼光譜特征峰和峰位歸屬[23-25]Table 2 Assignment of Raman bands of proteins in egg yolk liquid[23-25]

圖 4 不同熱處理條件的酶改性蛋黃液與未改性蛋黃液拉曼光譜Fig. 4 Raman spectra of proteins in modified and unmodified egg yolk liquid under different heat treatments

各組蛋黃液蛋白質的拉曼光譜特征峰和峰位歸屬見表2，根據表中峰位歸屬與頻率之間的對應關系在圖4中標注出各樣品相應的拉曼譜帶及變化。拉曼光譜中拉曼位移和相對強度可以反映酶改性蛋黃液中蛋白質在熱處理前后所處環境和構象變化等信息。由于苯丙氨酸結構相對穩定，在1 003 cm－1處的特征峰不易受到外界環境變化的影響，故將其作為歸一化因子對各樣品的拉曼圖譜進行歸一化處理。由圖4可知，譜線發生不同程度的位移，說明改性后熱處理蛋黃液中蛋白質的化學鍵數目發生變化。各拉曼光譜的峰頻率和強度也發生了變化，反映出蛋白質空間構象的變化。

2.3.1 酰胺I帶構象變化

拉曼光譜中的酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）對于研究蛋白質二級結構最有價值。位于1 665 cm－1左右的強特征峰主要來源于C＝O雙鍵的伸縮振動和N—H鍵的彎曲振動，大量研究表明，酰胺I帶可以準確反映出蛋白質主鏈結構的變化，同時，酰胺I帶也可用于蛋白質二級結構相對含量的定量分析[15,26]。

表 3 不同熱處理條件下酶改性蛋黃液與未改性蛋黃液中蛋白質二級結構相對含量Table 3 Relative contents of secondary structures of proteins in modified and unmodified egg yolk liquid under different heat treatments

由表3可知，蛋黃液中蛋白質二級結構組成為α-螺旋54.82%、β-折疊26.90%、β-轉角10.90%、無規卷曲6.35%。這與呂雪娟等[27]的研究結果基本一致。蛋黃液中的蛋白質二級結構以α構象為主，表明蛋黃液中蛋白質分子內部氫鍵相互作用較強。從表3中還可以看出，β-折疊相對含量減少時α-螺旋相對含量增加，即在加熱過程中β-折疊轉化為α-螺旋結構。在加熱過程中，未改性蛋黃液蛋白質二級結構中β-折疊、β-轉角及無規卷曲結構相對含量先減小后增大，超過65 ℃后又顯著下降；而α-螺旋結構相對含量則是先增大后減小，超過65 ℃后顯著上升。酶改性后蛋黃液α-螺旋及β-轉角結構在65 ℃條件下相對含量分別為最高和最低。蛋黃蛋白質的平均變性溫度為65 ℃，此時蛋黃液中蛋白質的二級結構變化最為明顯，酶改性蛋黃液α-螺旋結構相對含量顯著高于未改性蛋黃液，無規卷曲結構相對含量明顯低于未改性蛋黃液。這說明酶改性改變了蛋白質內的氫鍵作用，蛋白質有序性增加。

2.3.2 基團微環境變化

2.3.2.1 色氨酸殘基的變化

色氨酸會產生多個拉曼光譜譜帶，對于研究蛋白質微環境的極性及氫鍵變化有著重要價值。在759 cm－1左右的譜帶是由吲哚環振動引起的，其對色氨酸殘基微環境的極性十分敏感，處于“包埋”狀態的色氨酸殘基較“暴露”狀態下的拉曼譜帶強度更高[28]。

由表4可知，經酶改性后蛋黃液的色氨酸譜帶強度上升，表明色氨酸殘基微環境轉由“包埋”狀態微環境轉為“暴露”狀態，蛋白質結構有所展開。隨著熱處理溫度升高，蛋黃液的色氨酸譜帶強度均下降，說明熱處理不利于色氨酸殘基“暴露”在極性微環境中。在相同熱處理溫度下酶改性蛋黃液色氨酸譜帶強度均高于未改性蛋黃液，說明酶改性技術有助于蛋黃蛋白質在熱處理過程中保持其色氨酸殘基所處的微環境，從而提高或保持其功能性質。

表 4 不同熱處理條件下酶改性蛋黃液與未改性蛋黃液中色氨酸、酪氨酸雙峰比和C —H振動譜帶強度Table 4 Normalized intensities of tryptophan band, tyrosyl doublet,and C-H band of proteins in modified and unmodified egg yolk liquid under different heat treatments

2.3.2.2 酪氨酸殘基的變化

酪氨酸對羥苯基環的呼吸振動和環平面外彎曲振動倍頻之間的費米共振引起的850 cm－1和830 cm－1處的雙峰是構象靈敏的譜線，隨側鏈微環境變化而改變。當酪氨酸雙峰比（I850cm－1/I830cm－1）不低于1時說明酪氨酸殘基處于“暴露”狀態，而酪氨酸雙峰比小于1時說明酪氨酸殘基處于“包埋”狀態[29]。

由表4可知，未改性前蛋黃液酪氨酸雙峰比為0.99，經酶改性后蛋黃液的酪氨酸雙峰比為1.62，表明酪氨酸殘基微環境轉由“包埋”狀態轉為“暴露”狀態。經過熱處理后，蛋黃液的酪氨酸雙峰比均有所下降，說明熱處理不利于極性微環境中酪氨酸殘基的“暴露”。在相同熱處理溫度下酶改性蛋黃液酪氨酸雙峰比均高于未改性蛋黃液，且酶改性蛋黃液中的酪氨酸殘基始終處于“暴露”狀態。

2.3.2.3 脂肪族C—H鍵彎曲振動變化

在1 450 cm－1附近可以觀察到—CH3、—CH2的彎曲振動。由表4可知，經酶改性后蛋黃液的C—H振動譜帶強度顯著上升，表明更多疏水基團暴露到極性微環境中[30]。疏水作用的改變會進一步影響蛋白質結構[31]。隨著熱處理溫度的升高，蛋黃液的C—H振動譜帶強度顯著上升，說明熱處理有利于脂肪族疏水基團的“暴露”。在相同熱處理溫度下，酶改性蛋黃液C—H振動譜帶強度均高于未改性蛋黃液，說明酶改性技術可以減緩熱處理過程中因蛋白聚集導致的疏水基團包埋并向微極性環境的轉變。

綜上所述，酶改性有利于色氨酸殘基、酪氨酸殘基及脂肪族疏水基團“暴露”到極性微環境中，同時減緩熱處理過程中因蛋白聚集導致的疏水基團包埋并向微極性環境的轉變。Kato等[17]研究發現蛋黃蛋白質的EAI和ESI與表面疏水性線性相關，這與本研究結果一致。

2.3.3 基于拉曼光譜的乳化性質模型

選取經熱處理的蛋黃液樣品共8 組（酶改性4 組、未改性4 組），每個樣品分別在同一基底的2 個不同位置取點進行拉曼光譜測試，將得到16 組圖譜數據作為樣本集，用于PLS模型的建立。蛋黃液EAI及ESI的PLS模型如圖5所示。

圖 5 蛋黃液EAI（A）及ESI（B）的PLS模型Fig. 5 PLS models for EAI (A) and ESI (B) in egg yolk liquid

由圖5可以看出，在EAI的PLS模型中，1 155、1 519、1 652、1 700～1 900 cm－1附近的拉曼峰在模型中占較大的比例；在ESI的PLS模型中，1 065～1 120、1519 cm－1附近的拉曼峰在模型中占較大的比例。1 519 cm－1及1 155 cm－1附近的拉曼峰為蛋黃中LDL的特征峰，分屬于烷基鏈C＝C伸縮振動及—CH2不對稱彎曲振動。1 700～1 900 cm－1附近的拉曼峰主要包含了酰胺I帶及C＝O伸縮振動帶。由圖6可知，該模型具有較好的預測能力，蛋黃液EAI的PLS模型R2＝0.992，均方根誤差為0.120；蛋黃液EAI的PLS模型R2＝0.978，均方根誤差為0.334。通過對乳化性質預測模型的分析可知，蛋黃液中蛋白質二級結構及構象變化特別是LDL的構象變化對蛋黃液乳化性質影響最大。

圖 6 蛋黃液EAI（A）及ESI（B）的PLS模型回歸驗證Fig. 6 Regression validation of PLS models for EAI (A) and ESI (B)

3 結 論

本實驗主要研究了不同熱處理條件對酶改性蛋黃液乳化性質的影響，利用拉曼光譜分析蛋黃液中蛋白質的構象變化。結果表明，隨著熱處理溫度的升高，酶改性蛋黃液的EAI呈現下降趨勢，所形成的乳化體系粒徑表現出增大的趨勢。經過同等溫度的熱處理后，酶改性蛋黃液的EAI及ESI均顯著高于未改性蛋黃液，所形成的乳化體系粒徑顯著小于未改性蛋黃液且更加均一。拉曼光譜分析結果顯示，經熱處理后，酶改性蛋黃液中蛋白質的α-螺旋結構相對含量顯著高于未改性蛋黃液，無規卷曲結構相對含量顯著低于未改性蛋黃液，色氨酸殘基、酪氨酸殘基及脂肪族疏水基團充分暴露。通過對拉曼光譜乳化性質預測模型的分析表明，蛋黃液中蛋白質二級結構及構象變化特別是LDL的構象變化對蛋黃液乳化性質影響最大，通過酶改性技術可以促使蛋黃液中蛋白質的二級結構及構象向著有利于提高乳化性質的方向轉變。在后續研究中，應深入研究蛋白質的二級結構及構象變化影響蛋黃液功能性質的機理，為開發具有高乳化性的蛋黃液產品提供理論指導。