硒化低聚氨基多糖對免疫抑制小鼠免疫器官及腸緊密連接蛋白表達的影響

湯 震，顧麗霞，相興偉,2,*，聞正順,*，曲有樂，鄭 斌,2，宋厚輝

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋開發研究院，浙江 舟山 316021；3.浙江農林大學動物科技學院，浙江 杭州 311300）

免疫低下是免疫系統異常的病理性特征，免疫系統包括免疫器官和免疫組織[1]。其中腸黏膜是機體最大的免疫組織，處于被大量抗原包圍的狀態，具備防御腸內致炎因子及致病微生物入侵的功能[2-3]。腸黏膜組織遭到破壞會引發許多腸源性疾病[4-5]。腸黏膜上皮細胞之間的緊密連接為主要連接方式[6]，緊密連接分子是由3 種膜蛋白（閉鎖蛋白（Occludin）、緊密連接蛋白和連接黏附分子）以及閉合小環蛋白（zonula occludens，ZO）家族組成，緊密連接分子表達量是反映腸道緊密連接屏障功能和通透性功能的重要指標[7-8]。其中ZO-1與Occludin定位于細胞連接處，二者是表達緊密連接屏障功能的重要蛋白，對保持緊密連接的完整性起到關鍵作用[9-10]。因此，闡明緊密連接分子表達量的變化，對認識腸黏膜屏障功能、預防與治療某些腸道疾病具有重要意義。

目前，硒元素被認為具有增強機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤的生物學功能，常用的補硒方式為補充以亞硒酸鈉為代表的無機硒，其吸收轉化率低且使用受到限制，使用不當會產生許多副作用[11]。通過攝入有機硒的方式補充機體所需硒元素能夠提高其轉化率并降低毒副作用。目前，對有機硒的開發引起了研究者的關注，其中硒多糖可發揮多糖、硒的雙重生物活性，因此學者們對其研究尤為重視[12]。前期研究結果表明，硒化低聚氨基多糖（low-molecular-mass seleno-aminopolysaccharide，LSA）具有較低的毒性，且含有較高含量的多糖和更高生物活性的硒[13]，具有提高機體免疫功能、改善斷奶應激引起的腸道免疫失調的作用[14-15]。本實驗采用腹腔注射環磷酰胺（cyclophosphamide，CPA）建立小鼠免疫抑制模型，研究LSA對免疫低下小鼠組織形態、回腸ZO-1及OccludinmRNA表達的影響，進而探討LSA對免疫抑制小鼠的免疫器官及腸道組織的保護作用，以期為將其開發為免疫調節劑提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康BALB/c雄性小鼠80 只，6～8 周齡，體質量18～22 g，購自浙江省醫學科學院，生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016。實驗前小鼠適應性飼養3 d，自由取食飲水。

CPA 美國Sigma公司；低聚氨基多糖 浙江金殼生物化學有限公司；LSA 浙江海洋大學海洋藥物研究實驗室；TRIzol試劑 美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq日本Takara公司；DEPC水（RNase-Free水） 生工生物工程（上海）股份有限公司；亞硒酸鈉、乙醇、異丙醇、多聚甲醛、冰乙酸均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GelDoc XR System凝膠成像系統、MyCycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Multiskan FC全自動酶標儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；CKX41倒置顯微鏡 深圳市宇德立生物科技有限公司；ZHJH-C1209C型垂直流超凈工作臺上海智城儀器制造有限公司；ABI ViiA? 7實時熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥

小鼠按體質量隨機分為8 組，分別為空白組（Con組）、模型組（CPA組）、3 種劑量LSA組、亞硒酸鈉組（SE組）、低聚氨基多糖組（LA組）、亞硒酸鈉與低聚氨基多糖復合組（SELA組），每組10 只。空白組與模型組灌胃生理鹽水，LSA1、LSA2、LSA3組分別按照0.3、0.6、0.9 mg/（kgmb·d）劑量灌胃LSA，SE組灌胃Na2SeO3（0.3 mg/（kgmb·d）），LA組灌胃低聚氨基多糖（9.87 mg/（kgmb·d）），SELA組灌胃Na2SeO3（0.3 mg/（kgmb·d））＋低聚氨基多糖（9.87 mg/（kgmb·d）），連續灌胃14 d；除空白組外，其他組在第11、12、13、14天腹腔注射50 mg/kgmbCPA，每日1 次。

1.3.2 小鼠臟器指數的測定

末次給藥24 h（禁食）后，小鼠稱體質量，眼球取血，頸椎脫臼處死，隨后迅速摘取脾臟和胸腺，用生理鹽水洗滌臟器后用濾紙吸干水跡，分別稱質量，記錄。按照下式計算臟器指數。

1.3.3 小鼠脾臟、空腸組織形態學觀察

新鮮脾臟與空腸組織用生理鹽水多次沖洗，洗去殘留血液，加10 mL體積分數4%多聚甲醛溶液常溫固定24 h，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機將組織石蠟塊連續切成6 μm組織切片，每個組織塊隨機選取兩張進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，顯微鏡下觀察組織病理變化情況。

1.3.4 小鼠回腸組織緊密連接蛋白mRNA表達水平測定

1.3.4.1 總RNA提取與反轉錄

小鼠回腸組織在液氮中進行充分研磨，收集回腸組織粉末，每0.1 g小腸組織加1 mL TRIzol試劑，室溫靜置5 min充分裂解細胞；加入0.2 mL氯仿，用力振蕩離心管15 s（使溶液充分乳化，呈乳白狀且無分層現象），4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入等體積預冷異丙醇，充分混勻，－20 ℃靜置30 min使RNA沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，移除上清液，加入4 ℃預冷的體積分數75%乙醇溶液（DEPC水配制）1 mL，離心，溫和洗滌沉淀，重復2 次，置于通風櫥內使乙醇揮發；加適量DEPC水溶解RNA，即得RNA樣品。取1 μL RNA樣品用核酸蛋白定量儀檢測OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm及RNA質量濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性。取上述RNA樣品進行反轉錄得到cDNA，具體操作依照反轉錄試劑盒說明書進行。

1.3.4.2 引物設計

表 1 ZO-1、Occludin的實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

設計并合成小鼠ZO-1、Occludin特異性引物，具體序列見表1。用SYBR Green法對反轉錄所得cDNA模板進行實時熒光定量PCR檢測（以β-actin作為內參基因）。

1.3.4.3 實時熒光定量PCR擴增

取適量上述cDNA樣品，依照熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作。以cDNA為模板，用目的基因引物進行實時熒光定量PCR分析，擴增體系為：10 μL SYBR Green qPCR mix、0.4 μL ROXII、2.0 μL cDNA、10 μmol/L上游引物0.4 μL、10 μmol/L下游引物0.4 μL、dH2O 6.8 μL，總計20.0 μL。

將上述體系按照如下程序進行擴增：50 ℃、120 s，95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，各靶基因相應退火溫度退火60 s，40 個循環。溶解曲線的繪制按照熒光定量PCR儀的說明書進行。每個樣品靶基因的相對mRNA表達水平用2－△△Ct法計算，每組別樣品進行4 個重復。

1.4 數據統計與分析

實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，各組間釆用最小顯著性差異法進行多重比較檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 LSA對小鼠臟器指數的影響

與空白組比較，模型組小鼠連續腹腔注射4 d CPA后，出現厭食、精神委頓等臨床表現。對各組小鼠體質量、脾臟及胸腺指數進行測定，結果如表2所示。與對照組相比，CPA顯著降低了小鼠脾臟和胸腺指數（P＜0.05）。與模型組相比，灌胃LSA能顯著提高小鼠脾臟及胸腺指數（P＜0.05）。此外，與模型組小鼠相比，SE組、LA組及SELA組小鼠的胸腺、脾臟指數均無顯著性變化。

表 2 LSA對小鼠胸腺指數及脾臟指數的影響Table 2 Effect of LSA on body mass, thymus index and spleen index in mice

2.2 LSA對小鼠脾臟組織形態的影響

圖 1 LSA對小鼠脾臟組織形態的影響（×100）Fig. 1 Effect of LSA on spleen morphology of mice (× 100)

器官的組織結構是其發揮功能的基礎。脾臟分為被膜和實質，脾實質的淋巴組織由白髓和紅髓組成。由圖1可知，空白組小鼠脾臟結構清晰，白髓、紅髓界限明顯，白髓面積大；模型組小鼠脾臟結構較模糊，白髓和紅髓界限不清，白髓面積明顯縮小；與模型組比較，中、高劑量LSA組小鼠脾臟結構較清晰，紅髓和白髓界限較明顯，白髓面積增大。結果提示攝入LSA對小鼠脾臟組織有保護作用。

2.3 LSA對小鼠空腸組織形態的影響

圖 2 LSA對小鼠空腸組織形態的影響（×100）Fig. 2 Effect of LSA on histopathological observation of the mice jejunum (× 100)

如圖2所示，空白組（圖2A）小腸絨毛排列整齊、細長緊密、隱窩較深、腸壁厚實；而模型組（圖2B）小腸絨毛松散且絨毛結構出現破損，部分絨毛甚至出現斷裂、脫落的現象，隱窩變淺，腸壁變薄；低劑量LSA組小鼠小腸絨毛形態無明顯改善，中、高劑量LSA組（圖2D、E）小腸絨毛形態略有好轉，相對模型組和低劑量LSA組，絨毛結構較完整，破損狀態有所好轉，排列較整齊。上述結果提示攝入LSA對小鼠空腸組織有一定的保護作用，能夠緩解CPA導致的腸道損傷。

2.4 總RNA純度和完整度分析結果

采用微量核酸定量儀檢測RNA OD260nm/OD280nm，結果顯示其值都在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA無明顯的鹽類、DNA及蛋白等其他有機物污染。如圖3所示，有清晰的28S、18S及5S條帶，其中28S條帶亮度基本是18S的兩倍，5S條帶亮度較弱，且條帶與條帶之間無明顯拖尾現象，表明總RNA較完整，基本無降解。因此，所提樣品總RNA質量可靠，可用于后續實驗。

圖 3 部分小鼠回腸組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 3 Agarose gel electropherogram of total RNA from ileum tissue of mice

2.5 回腸組織緊密連接蛋白mRNA表達水平

由4圖可知，與空白組比較，模型組小鼠回腸ZO-1和OccludinmRNA表達量均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，灌胃LSA后，免疫抑制小鼠回腸ZO-1及OccludinmRNA表達量有所上升，其中，中、高劑量LSA組的ZO-1、OccludinmRNA表達量顯著升高（P＜0.05），且中劑量LSA組的效果最好。但是SE組、LA組及SELA組小鼠回腸ZO-1、OccludinmRNA表達量與模型組相比變化不顯著。

圖 4 LSA對小鼠回腸ZO-1（A）和Occludin（B）mRNA表達水平的影響Fig. 4 Effect of LSA on mRNA expression of ZO-1 (A) and occludin (B)in ileum of immunosuppressed mice

3 討 論

研究表明，硒作為機體必不可少的微量元素之一，在體內起著非常重要的作用，尤其在氧化還原系統、內分泌系統和免疫調節系統方面[16-18]，但亞硒酸鈉具有較大的毒性，副作用較大。為解決以亞硒酸鈉補硒方式中硒毒性的問題，硒多糖作為一種低毒、高活性有機硒成為了研究的焦點，許多學者利用多糖的羥基作為結合位點與亞硒酸鈉反應制備硒多糖，研究其活性。劉寬輝等證明多糖-硒化多糖復方可以增強免疫活性[19]；于闖發現經亞硒酸鈉化學修飾后的茶多糖（Cse-tps1）活性明顯比普通茶多糖（Tps1）強，其中Cse-tps1主要是以Vas C—O—Se和O—H—Se與多糖進行結合[20]；羊雪芹等通過建立CPA誘導的免疫抑制小鼠模型研究Z0206細菌富硒，發現細菌富硒多糖能增強小鼠的免疫功能，對CPA誘導的免疫抑制具有緩解作用[21]。與單一羥基結合位點的多糖相比，本研究中使用低聚氨基多糖存在氨基、酰胺基結合位點，能夠提高的硒化效率，研究結果表明硒化修飾增強了低聚氨基多糖的生物活性。

免疫抑制是機體免疫功能異常的一種表現，是指機體在單一或多種致病因素的作用下，免疫系統受到損害，導致機體出現暫時性或是持久性的免疫應答功能紊亂，從而產生對疾病的高度易感性[22]。CPA作為一種臨床上常用的化療藥物，其在發揮良好的抑制腫瘤細胞生長作用的同時也對正常細胞產生了一定的毒副效應，從而造成機體免疫系統損傷。因此，在免疫學研究中，常以CPA作為制備免疫抑制模型的藥物。本實驗采用腹腔注射CPA建立了BALB/c小鼠免疫抑制模型，實驗結果顯示，小鼠連續4 d腹腔注射CPA后產生了明顯的免疫抑制癥狀，行為學上主要表現為厭食、精神委頓等，小鼠免疫器官（脾臟、胸腺）臟器指數明顯減小；病理切片HE染色結果顯示，模型組小鼠脾臟發生病理性結構變化，與其他文獻報道的結果[23-25]基本一致。機體免疫器官由中樞免疫器官和周圍免疫器官兩大部分組成，本研究所涉及的胸腺、脾臟分別屬于中樞免疫器官和周圍免疫器官，兩者的臟器指數在某種程度上能反映機體免疫功能的高低。因此，本實驗考察了小鼠的胸腺及脾臟指數，結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠胸腺及脾臟指數明顯下降，灌胃LSA后的小鼠胸腺及脾臟指數顯著上調，說明LSA對CPA所致免疫器官萎縮有一定的預防和保護作用。本實驗進一步通過病理切片HE染色觀察了小鼠脾臟組織的結構形態，結果顯示，較空白組小鼠，模型組小鼠的脾臟結構較模糊，紅髓、白髓界限不明顯，白髓面積小；灌胃LSA后，小鼠脾臟結構較清晰，紅髓、白髓分界比較明顯，白髓面積增大。小鼠脾臟、胸腺指數及脾臟形態學觀察結果提示LSA能在一定程度上逆轉CPA引起的變化，改善CPA對小鼠胸腺及脾臟造成的損傷。

腸道不僅是機體消化食物和吸收營養物質的主要場所，同時也是許多病原體入侵或起始感染的主要位點[26-27]。腸內淋巴細胞較多，且腸道接觸抗原的表面積較大，因此腸道還是機體最大的免疫組織，其免疫屏障功能的正常發揮對維持機體整體免疫起著至關重要的作用[28-29]。CPA對增殖迅速的組織細胞存在強大的殺傷作用，而被應用為一種常用的惡性腫瘤化療藥物，但因其特異性不強，易產生多種副作用，其中胃腸道不良反應發生率最高，主要表現為食欲下降、嘔吐、腹瀉等[30]。本實驗發現，BALB/c小鼠連續4 d腹腔注射CPA后出現小腸絨毛破損、變短、排列稀疏，細胞間緊密連接分子ZO-1和OccludinmRNA表達水平顯著下降等變化，與文獻[31-32]結果基本一致。腸腔內抗原物質的抵御作用依賴于腸道組織結構的完整性，其中小腸絨毛長度與結構的完整性在腸道黏膜免疫過程中起著重要的作用[33-34]。本實驗結果顯示，CPA對小腸絨毛結構有破壞作用，甚至出現部分絨毛脫落的現象，攝入LSA可以在一定程度上緩解CPA對腸絨毛結構的損傷，具有保護腸道的作用。ZO-1和Occludin是細胞間緊密連接的重要組成部分，腸道ZO-1、Occludin基因表達量結果顯示LSA能顯著恢復CPA所致細胞緊密連接分子表達的抑制，結合小鼠腸道HE染色結果，進一步證實了LSA對腸道的保護作用。綜上，本研究結果表明LSA具有一定的免疫調節功能及保護腸道作用，這將為LSA的開發與利用提供數據支撐。