植物多酚對肉制品蛋白氧化的抑制機理及其延長貨架期的應用

李文慧，劉 飛，李應彪，冉麗丹，侯 然，鐘媛媛，董 娟,*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.喀什大學生命與地理科學學院，新疆 喀什 844006）

目前，質量安全問題仍然是我國肉與肉制品加工和貯藏過程中面臨的一個重要問題。其中微生物污染和蛋白氧化會導致肉與肉制品色澤變差、風味惡化、持水性及嫩度下降、消化率降低、貨架期縮短等問題，這些不良變化不但給肉制品加工、生產、銷售帶來了難以估計的影響，而且對消費者的身體健康會產生不利的影響；因此，對肉與肉制品加工貯藏過程中蛋白氧化的有效控制及貨架期延長具有重要的現實意義。以往研究者對肉制品脂質氧化的抑制機理方面已進行了大量研究，對肉制品中蛋白氧化控制方面研究較少，但近年來其成為了研究熱點。蛋白質氧化修飾主要發生在氨基酸側鏈上，包括巰基氧化、芳香族羥基化和羰基的形成[1-2]。氧化劑可以直接攻擊蛋白質的骨架，引起蛋白質二級和三級結構的碎裂和構象變化。肉制品氧化誘導形成的二硫鍵、二酪氨酸和其他分子間的橋連作用導致蛋白質聚集，使肉與肉制品中蛋白質的營養價值下降[3-4]。還有研究表明，不適當的屠宰、操作和貯藏會導致肉中微生物繁殖和交叉污染，包括沙門氏菌和引起食源性疾病的單核細胞增生李斯特氏菌，造成嚴重的經濟損失[5]。因此，尋找控制肉與肉制品加工與貯藏中蛋白質氧化和微生物污染的有效方法是非常必要的。

多年來，合成的抗氧化劑和抑菌劑能夠作為自由基清除劑和金屬螯合劑抑制肉中蛋白氧化和延長貨架期[6]。有毒理學報告指出，合成的抗氧化劑和抑菌劑有潛在增加心血管疾病、肥胖癥和癌癥等疾病患病風險的可能[7-8]。隨著人們生活水平的提高和健康意識的增強，綠色天然食品越來越受到消費者青睞，因此植物多酚取代合成抗氧化劑和抑菌劑已是大勢所趨[9]。目前，富含酚類的植物提取物在肉制品中的應用已成為研究熱點，如天然植物多酚在肉與肉制品中的抗氧化作用、植物多酚對微生物的抑制機理及其對肉制品品質的影響等研究具有重要的理論價值。

1 植物多酚分類、來源

天然多酚可以分為3大類，即黃酮類化合物、芪類和酚酸類[10]。黃酮類化合物是在植物和真菌中發現的一類次級代謝產物，在化學結構上，黃酮骨架由2 個苯環和1 個含氧雜環組成，具有15碳（C6-C3-C6主鏈）骨架結構。研究者們已經從各種植物中分離出5 000多種黃酮類化合物，大致分為黃烷醇、黃烷酮、黃酮、異黃酮、黃酮醇和花青素[11]。花青素是黃酮類化合物最重要的亞類，廣泛分布于水果和蔬菜中[12-14]。茶葉和可可豆中發現的主要黃酮類是單體黃烷-3-醇（兒茶素）及其衍生物（表兒茶素、沒食子兒茶素）[15]。木本植物、水果、啤酒和葡萄酒中的主要黃酮類組分是濃縮單寧和原花青素，這些聚合物可以沉淀蛋白質并具有抗菌活性。

芪類是14碳（C6-C2-C6）骨架，具有單體、低聚體和聚合物結構[16]。白藜蘆醇屬于芪類單體，具有多種生物活性，如抗氧化、抗癌和抗菌活性。在葡萄、漿果、花生、可可以及紅葡萄酒中均發現了白藜蘆醇[17]。

酚酸是植物界中廣泛分布的次生代謝產物，可以在堿性介質或酶促反應中水解。酚酸是一類苯環上含有一個或多個羥基的化合物，按結構可分為苯甲酸和苯乙烯型（羥基肉桂酸）[18]。羥基苯甲酸包括沒食子酸、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草酸和丁香酸。最常見的羥基肉桂酸包括咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸和芥子酸[19]。

2 植物多酚對肉制品蛋白氧化的抑制機理

蛋白氧化定義為通過活性氧（reactive oxygen species，ROS）直接誘導，或通過氧化應激的次級產物間接誘導蛋白質共價修飾，一般來說ROS可以介導蛋白質氧化，即自由基（羥自由基（?OH）、超氧陰離子自由基（）、烷過氧基（ROO?）、烷氧基（RO?）、一氧化氮自由基（NO?）及活性物種、多不飽和脂肪酸遇高溫形成的自由基）、氧的非自由基衍生物（H2O2、HOCl、過氧化物）或過渡金屬離子（Fe2＋、Cu2＋）會促進蛋白氧化[20-21]。研究表明植物中的酚類化合物與肉和肉制品中蛋白質的共價結合可以抑制蛋白氧化，植物多酚的抗氧化能力與其含量相關[22]。植物多酚抑制蛋白質氧化機理可歸納為以下幾點。

2.1 多酚作為自由基和活性物質的清除劑

蛋白氧化過程涉及到自由基的形成和反應，肉制品中的鐵離子可與H2O2反應產生具有強氧化能力的?OH，NO帶有自由基，化學性質非常活潑，研究發現NO為蛋白質氧化的前體物[23]。由于植物多酚中苯環上存在羥基結構，可通過氫原子轉移機制將酚羥基基團上的氫原子向自由基轉移而清除自由基（Ar—OH＋R?→ArO?＋RH）[24-25]，di Meo等[26-27]提出了4 種可能導致這種反應的機制：1）氫原子轉移和質子耦合電子轉移（Ar—O··H→Ar—O?＋H?；R?＋H?→RH）。該機制是純氫原子的直接轉移，自由基清除活性完全由酚羥基基團上O—H鍵的均裂解離控制，多酚電子轉移到自由基單獨占據的分子軌道。2）電子轉移 質子轉移。根據自由基與酚羥基反應的氧化體系，這種機制作為次要機制發生，是由電子轉移引起（ArOH＋R?→ArOH?＋＋R－），然后是質子釋放（ArOH?＋＋R－→ArO?＋RH）。3）連續質子損失-電子轉移。該機制由質子損失引起（ArO－H→ArO－＋H＋），然后多酚陰離子進行電子轉移（ArO－＋R?→ArO?＋R－；R－＋H＋→RH）。4）在放射溶液中，加合物形成（ArO—H＋R?→[ArOH－R]?；[ArOH－R]?→ArO?＋RH），這種機制對?OH具有相對特異性，該基團可以在雙鍵和芳香環上加成。

Xiong Youling L.[28]研究指出將植物酚類（兒茶素、咖啡酸、綠原酸、迷迭香）加入牛肉餡餅和炸丸子中，植物多酚會以清除自由基的方式來抑制蛋白質的氧化修飾。Soladoye等[3]研究發現，自由基與肉制品蛋白質多肽主鏈的特定位點發生反應，導致其碎裂和氨基酸側鏈的修飾。Gül?in等[29]通過紅外單線態氧（1O2）化學發光法證明，作為清除劑，單寧酸比合成抗氧化劑丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯和α-生育酚更有效，1O2是肉制品加工中常出現的一種自由基和高反應性分子，多酚（單寧酸）可作為電子和質子供體使單線態氧氧化程度大大降低。

植物多酚在肉與肉制品中抗氧化性與其清除自由基活性有關[30-32]。在肉與肉制品加工、貯藏和光照過程中會導致活性物質形成，從而破壞蛋白質結構、功能特性，并降低產品營養價值和感官可接受性，甚至產生有毒化合物。逯陽[33]認為，植物酶的活性非常強，其中超氧化物歧化酶可將ROS、活性氮轉變為相對穩定的化合物，減少自由基的產生從而發揮抗氧化作用。Zhang Yumeng等[34]研究發現，肌原纖維蛋白在肉制品加工過程中很容易受到ROS的攻擊，β-環糊精（β-cyclodextrins，β-CDs）與表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）相互作用，形成的β-CD-EGCG復合物可以減少ROS攻擊并提高肉制品的凝膠強度。

2.2 多酚作為非自由基衍生物的清除劑

H2O2在肉制品中是一種具有強氧化作用的非自由基衍生物，在Fe2＋存在的情況下，其可將H2O2還原產生?OH，由于酚類化合物是良好的電子和質子供體，植物多酚將?OH轉化成水，從而清除非自由基，達到抑制肉和肉制品蛋白氧化的目的[16]。Fenton反應被認為是?OH的主要來源，其中Fe3＋是肌肉蛋白氧化的起始因子。除了Fe3＋外，其他過渡金屬離子在H2O2存在的條件下也會引發蛋白質氧化[35]。幾乎所有的過渡金屬離子都有能力在不同的氧化態中發揮作用，在活性氧化還原態中，過渡金屬離子可以作為許多生物分子自動氧化的催化劑。在大多數情況下，具有氧化還原活性的過渡金屬離子與H2O2反應產生羥自由基進而引發氧化，稱為Fenton反應[36]。

2.3 多酚作為過渡金屬離子的螯合劑

Adjimani等[37]使用咖啡酸-鐵螯合劑作為體外抗氧化劑的實驗結果表明，咖啡酸-鐵螯合劑可通過清除ROS和自由基而起到抗氧化劑的作用，減少由Fenton反應產生?OH的量，從而減少肉類蛋白質的氧化。Gül?in[38]認為，Fe3＋是血紅素和鐵蛋白釋放出來的最豐富的離子，是蛋白質氧化的重要催化劑，當Fe3＋被植物多酚螯合時，它可能失去其助氧化劑性質。白藜蘆醇的結構及其與金屬離子螯合作用的結合位置見圖1A，白藜蘆醇可以利用其兩個羥基螯合Fe2＋。同時，Liu Yuanzhen等[39]利用電噴霧串聯質譜研究了第一過渡金屬離子（Fe3＋、Co2＋、Ni2＋、Cu2＋和Zn2＋）對金屬離子-類黃酮螯合物形成和穩定性的影響，通過全掃描質譜，發現Fe2＋與槲皮素主要形成化學計量比為1∶2和2∶3的金屬-類黃酮螯合物，而Cu2＋和槲皮素主要形成化學計量比為1∶1和1∶2的金屬-類黃酮螯合物（圖1B）；螯合分子的數量會隨著金屬離子半徑的減小而減少，槲皮素通過其5-OH和4-羰基與二價金屬離子形成不同的絡合物。脂質氧化中引發自由基鏈的主要途徑是通過H2O2介導血紅素蛋白的降解，使肉制品釋放游離鐵，或者將血紅素鐵迅速地還原為鐵氰化物自由基，肉制品中含血紅素蛋白的鐵在脂質過氧化的催化中起著關鍵作用[40]。

圖 1 白藜蘆醇（A）、槲皮素（B）與金屬離子的螯合Fig. 1 Chelation of resveratrol (A) or quercetin (B) with metal ions

2.4 多酚作為高鐵肌紅蛋白的還原劑

氧合肌紅蛋白（MbO2）是一種含有血紅素Fe（II）的蛋白質，其使肉呈鮮紅色。MbO2中Fe（II）被氧化成Fe（III），MbO2轉化成高鐵肌紅蛋白（MetMb），MetMb呈褐色，降低了肉的市場價值。除了顏色變化之外，MbO2的氧化會產生超氧化物自由基，由此加速了肉的氧化變質，因此控制MbO2的氧化對于維持肉品質至關重要。Lorrain等[41]研究發現，當多酚（芥子酸、兒茶素、紫杉葉素、桑色素和阿魏酸）濃度為600 μmol/L時會降低肉制品中MetMb含量，可以抑制MbO2氧化、減少MetMb的產生，使肉與肉制品保持良好的色澤。Inai等[42]通過研究植物相關酚類化合物對MetMb還原的影響發現，酚羥基可通過捕獲自由基來抑制肉制品的氧化，且單酚化合物的抗氧化活性不是很強，但鄰位和對位二酚化合物在體外的抗氧化活性很強。但在還原MetMb過程中，酚羥基容易受空氣氧化形成穩定的醌或半醌自由基，而醌或半醌自由基因含有α、β-烯酮具有親電子活性，會促進MbO2的氧化，使其不穩定。Masuda[43]、Honda[44]等認為，植物多酚的羥基結構并不是抑制MbO2氧化的必要條件，在等量的半胱氨酸存在下，半胱氨酸中的巰基具有有效的親核性和自由基反應性，會與氧化后的多酚反應，得到的產物將MetMb還原成MbO2。多酚結構中半胱氨酰被硫取代的數量影響著MetMb還原活性和MbO2的維持。具有兩個半胱氨酸殘基的羥基酪醇衍生物具有最高的MetMb還原活性并且對MbO2沒有影響。以兒茶素為例，其還原MetMb的機理具體見圖2。

圖 2 兒茶素還原MetMb的機理Fig. 2 Mechanism of action of catechin as a reducing agent for MetMb

3 植物多酚在延長肉制品貨架期中的應用

近年來對植物多酚抑菌機理的探究比較熱門，由于多酚結構多樣，不可能預測每個類別結構特征多酚的抑菌活性以及細菌與多酚之間的作用機理[45]。因此，植物多酚的抑菌活性機理仍需進一步研究。植物多酚抗菌機理可歸納為以下幾點。

3.1 與細菌細胞壁的相互作用

圖 3 多酚對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑菌機理Fig. 3 Antibacterial mechanisms of polyphenols against Gram-negative and Gram-positive bacteria

革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的細胞壁不同，革蘭氏陰性菌細胞壁由肽聚糖和外層薄膜組成，革蘭氏陽性菌由一層厚的肽聚糖和磷壁酸組成。細胞壁在保護細胞的滲透壓中起重要作用；因此，對細胞壁的任何損害都會降低細胞對高離子強度和低滲透壓的耐受性[46]。許多研究人員已經證明了多酚與細菌細胞壁相互作用的能力，由于細胞壁組成的差異，革蘭氏陰性細菌對多酚的抵抗作用更強[47-48]。兒茶素、EGCG能夠直接結合金黃色葡萄球菌的肽聚糖，影響細胞完整性，從而降低細胞對高離子強度和低滲透壓的耐受性。Bukvi?ki等[49]將精油加入豬肉后針對單核細胞增生李斯特氏菌進行研究，結果發現用精油處理的豬肉成功地抑制了豬肉中單核細胞增生李斯特氏菌的增殖，使豬肉的顏色和風味得到改善。植物多酚對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌機理見圖3。

3.2 與細菌細胞膜的相互作用

董璐[50]、錢麗紅[51]、王慧敏[52]等研究發現，茶多酚能增加大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌、腐敗希瓦氏菌的細胞膜通透性，影響膜流動性，阻礙細菌蛋白質的正常表達，破壞細菌細胞膜的脂質層，使細菌發生形態學改變，從而影響細菌細胞結構以及酶的催化活性，抑制呼吸作用和改變離子轉運過程，最終導致細菌正常生理功能下降，產生良好的抑菌活性，為茶多酚應用在肉制品和水產品上延長其貨架期提供了理論依據。Phan等[53]研究發現，黃酮類化合物和反式芪化合物通過兩種完全相反的方式改變膜性質，由于沒食子酸酯、沒食子酰基和羥基的存在，類黃酮能夠與細菌膜脂質雙層的親水頭部基團形成氫鍵磷脂，形成的氫鍵磷脂主要影響脂質雙層的親水區域，介導磷脂的聚集，從而導致膜面積減小并使膜的剛性更強；具有開放芐基環結構的反式芪傾向于深入脂質雙層的疏水內部并增加膜面積，使膜的流動性增加。

3.3 抑制生物膜的形成

生物膜是肉類在屠宰和處理過程中，腐敗菌和病原微生物接觸并附著在肉類表面時為適應生存環境由菌體分泌而形成的一種胞外物質[54]。群體感應是細菌細胞間通過化學信號交流信息的一種有效通訊方式，可以調節一些功能（如毒力、抗生素生成和生物膜形成），在孢子形成和分散過程中執行專門的任務，當濃度達到閾值時，這些自動誘導物與轉錄調節物相互作用，允許特定表達一組基因，以響應高濃度的該自動誘導物[55-57]。此外，大多數細菌已經發展出精密的機制來黏附肉類固體表面和協調內部的活動，從而建立復雜的菌落，生物膜能夠保護細菌免受環境污染和攻擊，改善其對許多不同宿主的依賴，有效地獲取氧氣、營養物質維護、拆卸結構化的多細胞群落關鍵取決于細胞之間的化學通訊[58]。常見的肉類腐敗細菌（假單胞菌、乳酸桿菌）和食源性致病菌（沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌）在肉制品表面易形成生物膜，導致嚴重的衛生問題[59]。肖潔等[60]研究發現，茶多酚具有很強的抑制大腸桿菌（O157:H7）生物膜的能力。Bostanghadiri[61]、Giaouris[62]等發現，反式白藜蘆醇和精油對附著到肉表面的細菌生物膜具有顯著的抑制作用，其應用可減少肉類細菌、食源性細菌數量和延長肉類貨架期。細菌生物膜是微生物細胞彼此黏附在一起產生的，其具體結構和組成取決于物種和環境條件。生物膜黏附性使細菌難以從水管或食品加工設備表面完全清除，導致食源性疾病和食物腐敗的蔓延。有研究表明，熒光假單胞菌使用群體感應來控制生物膜形成和運動，肉桂醛可以通過與熒光假單胞菌的LuxR型蛋白相互作用的方式來抑制群體感應，對熒光假單胞菌生物膜形成明顯的抑制[63]。鞭毛是細菌重要的毒力因子，除了提供細菌運動相關功能外，還能在細菌生物膜形成初期及菌落生長過程中加快細菌黏附速度，當細菌黏附于固體表面后，細菌產生的胞外多糖對生物膜的形成和穩定結構起著重要作用，因此鞭毛在細菌生物膜形成過程中具有重要作用[64]。

3.4 抑制生物大分子的合成

抑制蛋白質合成是多酚抑菌作用的主要機理。多酚抑制細菌細胞的蛋白質、DNA和RNA等生物大分子的合成，使細菌的遺傳表達受到影響，細胞形態發生改變[65]。Gradisar等[66]研究表明，DNA旋轉酶是一種依賴于ATPI型的DNA拓撲異構酶，EGCG可通過抑制DNA旋轉酶的活性，使其失活而導致細菌死亡。大蒜素可以快速抑制鼠傷寒沙門氏菌RNA合成，并且可以部分抑制DNA合成，抑制微生物中的許多細菌酶活性，從而降低其毒力，因此大蒜素可用作抑菌劑或殺菌劑化合物[67]。

3.5 抑制細菌酶的活性

環二腺苷酸（cyclic di-adenosine monophosphate，c-di-AMP）是細菌核苷酸的第二信使分子，其作用包括控制不同細菌中的細胞壁動態平衡、細菌生長代謝、生物被膜形成、細菌毒力因子等。在枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌以及單核細胞增生李斯特菌等常見致病菌中均發現了c-di-AMP的存在[68]。Opoku-Temrng等[69]研究指出， DisA是細菌中最為普遍存在的c-di-AMP合成酶，c-di-AMP合成酶可利用ADP合成c-di-AMP；14 種植物多酚對枯草芽孢桿菌的DisA活性具有抑制作用，可通過抑制c-di-AMP的合成發揮抑菌作用。

4 結 語

植物多酚可作為反應性物質清除劑、非自由基衍生物清除劑、過渡金屬離子螯合劑和高鐵肌紅蛋白還原劑抑制蛋白氧化，同時多酚物質還可以通過與細菌細胞壁和細胞膜相互作用、抑制生物膜的形成等形式抑制肉制品中細菌物質的生長繁殖，來減緩肉與肉制品中蛋白質的氧化，從而延長肉與肉制品貨架期[70]。植物多酚為植物體內復雜酚類的次生代謝物，具有多元酚結構，主要存在于植物的皮、根、葉、果實中，在植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素。植物多酚具有抗氧化、抗菌、抗炎癥、抗過敏等生理功效，近年來成為人們關注和研究的熱點。隨著人們對純天然食品的重視，植物多酚或者富含多酚的植物提取物已經被越來越多地應用于肉制品中，用來抑制蛋白質和脂肪氧化、提高肉制品品質及營養價值，延長貨架期。植物多酚抑菌機理仍存在許多爭議，因其結構不同，抑菌機制應進行更深入系統的研究，其未來的研究前景仍十分廣闊。